这玩意儿看着就头大，对吧？
每次把流式抗体的目录拿到手上, 那上面满是密密麻麻的克隆号, 还有荧光素以及规格, 感觉就如同在看天书一样。说实在的, 在我刚刚开始接触的那段时间, 真的是晕得没办法了。
但后来慢慢摸出点门道了。
为什么买来的抗体总是染不好？
这是个灵魂拷问。
多数情形下并非抗体自身存在问题, 而是你根本就没选正确。比如说, 你打算对人外周血当中的T细胞进行染色, 然而却购买了一个仅能识别小鼠的克隆号, 这样子能得出结果才怪了呢。
还有个特别坑的地方——荧光素的选择。
有种荧光素格外娇弱, 诸如PE以及APC这类, 亮度确实高, 然而惧怕光线, 操作期间稍微迟缓一点, 信号便会衰减。至于FITC, 虽说稳定, 可亮度平常, 遇上表达量低的抗原, 基本上就是“你瞧不见我”。
因此你要先思索明白, 你所检测的这个抗原表达量是不是高, 你的机器激光配置是否足够, 别到了那个时候购买了APC-Cy7, 结果你那头台陈旧的机器根本激发不了, 这样就难堪了。
克隆号到底是个啥？为啥不能随便买？
克隆号这事儿，很多人觉得无所谓。
大错特错。
对应特定抗原表位着手设计的是每一个抗体, 不同的克隆号, 所识别的位置存在不一样的可能性, 就像CD4这种抗原, 有的克隆号识别的区域是胞外段, 而有的识别的则是胞内段, 倘若你开展胞内染色工作, 购买了识别胞外段的克隆号, 在固定破膜之后表位遭受破坏, 那么你所做的一切就只能是“白忙活一场”了。
还有更坑的——交叉反应。
有些克隆号宣称能够用于染人、小鼠以及大鼠, 然而实际上在某一物种上呈现出特别糟糕的表现。我所见到的最为凄惨的情况是, 有同事购置了一个号称适用于多种物种的抗体, 结果在浸染大鼠样本时, 所呈现出来的图像犹如雪花一般, 全部都是非特异性结合所导致的。
荧光素搭配有什么讲究？
这事儿说起来复杂，但其实记住几个原则就行。
别把光谱重叠严重的荧光素放一起用。
举例来说, FITC和PE - Alexa610是两个事物, 这两个彼此之间的光谱紧紧挨着十分靠近, 要是你将它们同时加以使用, 那么补偿根本调不妥善, 最终所呈现出来的散点图就是乱糟糟的一团。
再者, 对于那些表达量处于较低水平的抗原而言, 务必要采用最为明亮的荧光素。诸如PD - 1、CTLA - 4这类, 其本身表达程度就并非很高, 倘若你选用FITC去进行染色操作, 基本上就等同于在跟自身作对。
反过来说, 那种表达量比较高的抗原, 就像CD45这类的, 采用一个普通的荧光素便可以了, 并不需要去浪费亮度高的荧光素。
买散装还是买预混？
这个问题其实挺纠结的。
预先混合好的那种会比较省事, 只需添加一种就可以了, 不容易出现差错。然而问题在于, 在某些预先混合的组合当中, 某一个抗体的浓度有可能并非是你最为想要的那个浓度。
有着散装特性的灵活状态, 你能够自行去调整比例。然而每一次都需要单独操作进行添加, 多了这一步操作, 便多了一份出现错误的可能性。
倘若你是在进行那种常规的、已做过无数回的实验, 就像人外周血T细胞亚群分析这样的, 个人提议直接去买预混的会比较省心。然而要是做的是探索性的、得去调整组合的实验, 那自己去配置才相对更为靠谱。
保存和使用有啥坑？
在买回来之后, 很多都被放置到了4°C的冰箱里面, 就那样被扔掉了, 然而, 当使用一段时间后, 竟然发现其效果变得越来越差了。
实际上存在一些荧光素, 特别是诸如PE-Cy7这类串联染料, 极其容易发生降解。要是你长时间不使用, 那么最好在分装之后于-20°C的环境下进行保存, 不要反复进行冻融活动。
还有，用之前一定要离心。
许多人直接拿过来便使用, 然而当中聚集的颗粒致使背景高到令人恐惧的程度。进行离心操作后, 上清液变得干净, 相应的结果看起来也美观了。
操作的时候，避光避光避光！重要的事说三遍。
到底怎么选才不后悔？
说实话，没有万能的抗体。
你需要首先弄明白自身所涉及的实验体系, 具体是什么物种, 要明确是哪种组织, 需清楚是哪类抗原, 还要知晓使用的是何种机器。
接下来前往官网进行查询, 瞧瞧这个克隆号是否存在文献支撑, 是否于相似的样本之上经过验证。
要是真的确实没办法确定, 那就去购买小包装的来尝试一下, 千万别一开始就去买200 tests的那种, 倘若一旦不可以, 到时候哭都绝对来不及了。
尚有一小技巧, 即询同行, 于实验室群内发问, 没准便有人曾踩雷, 抑或寻得宝了。
在挑选抗体这件事情上, 确切来讲它基本上就是一项依靠经验的活儿, 经历过多次踩坑之后, 自然而然地就能够明晰该如何去避开那些坑洼了。
别怕，慢慢来，总会找到最适合你的那一支。
