我有一阵子特别崩溃。
养了一整个月的原代细胞，连续三批，全死。
并非是已经死去, 而是呈现出一种情形, 即渐渐地开始枯萎, 附着在壁上却并不牢固, 状态能够通过肉眼明显地察觉到在向下滑落, 随后到了某一个早晨, 当你前去查看培养箱时, 它们已然漂浮了起来, 恰似在秋天随风飘落的树叶那般。
那段时间我每天最怕的事就是推培养箱的门。你懂那个感觉吗？
什么叫大鼠原代细胞
其实很多人一开始就搞混了。
原代细胞, 非传代细胞系。就别指望它能似肿瘤细胞那般疯狂生长至怎么弄都绝不会死亡。原代细胞乃是从大鼠组织之中新鲜分离而得出的, 它留存下了体内绝大多数的生物学特性, 可同时也留存下了那般娇气的特质。
你要是给其把培养基更换一下, 它就会产生应激反应；你要是消化所花费的时间稍微长那么一点, 它就会以死来给你瞧；你要是离心时转速提升那么些许，它马上直接停止运作！
初次进行大鼠肝细胞原代分离之际, 我依照protocol按部就班地操作, 然而细胞得率却低到令人怜悯的程度。我耗费三天时间查找原因, 最终发觉乃是灌流速度太快所致——仅仅快了极为微小的那么一点。
所以干这行，真的得有一颗大心脏。
无菌操作到底重不重要
重要。太重要了。重要到我觉得怎么强调都不为过。
然而, 我所讲的无菌操作, 并非如你所想, 仅仅只需身着白大褂, 再喷洒些酒精便大功告成。实际上, 真正意义上的无菌状态, 是自你迈入细胞房那一瞬间便已然开启的。
我曾经有过一位同事, 这人聪慧过人, 只是对细节不太上心。他培养细胞时, 从不预先将培养基取出进行预热, 而是直接从4摄氏度拿出后就往里面添加。那时我还曾劝告过他, 他却表示没关系没关系, 仅仅就那么几秒钟而已。
自此之后, 他所培育的那群大鼠神经干细胞, 差不多每一瓶均遭受污染, 不是细菌造成的污染, 便是真菌引发的污染, 最为离谱的一回, 竟然生长出了霉菌的菌丝, 为此, 他全然白费了属于一个月时长的实验材料。
所以说，无菌不是口号，是习惯。
培养基是不是越贵越好
这是个好问题，也是个坑。
有那人拿大鼠心肌细胞来养, 去市面上挑了最贵的专用培养基来买, 结果细胞没养得好, 且出现大量死亡的状况。
出于何种缘由呢? 是鉴于原代细胞就渗透压、pH、氨基酸配比这些要素而言极为敏感。价格高昂的培养基并非必然适配你所拥有的细胞类型。
有着太多大鼠原代细胞种类啦: 有肝细胞、有神经元、有心肌细胞、有成纤维细胞、有骨骼肌细胞、还有内皮细胞等等……每一种都存在其独特营养需求。你就凭借一个配方贯穿全体所需用途来达成目标, 这是不切实际的。
消化酶浓度怎么把握
很多人在这一步翻车。
0.百分之二十五的胰酶, 就传代细胞系而言或许恰好合适, 然而针对原代细胞, 可能那会是毒药。
以我自身的经验来讲, 是宁肯少一些而不要多些, 宁肯短一点而非长一点。你能够先采用低浓度的消化酶，去延长消化的时间, 如此细胞受到的损伤就小。千万不要贪图速度上的快。
并且, 细胞源于不同组织, 其对于消化酶的耐受程度全然不同, 大鼠神经元极为敏感, 0.05%的胰酶进行一分钟的消化便基本可以, 而成纤维细胞则要皮实许多, 0.25%进行五分钟的消化也并无问题。
离心条件选错会怎样
会死得很惨。
我在早期进行大鼠原代细胞的分离之际 , 内心一直觉着 , 要是离心的转速稍微高起来一些 , 那么细胞沉淀就会更加地结实 , 从而便于收取。然而结果究竟如何呢? 在完成离心之后查看 , 却发现细胞全部破碎了 , 其活率竟然达不到50%。
那之后, 我师傅跟我说了一番言辞, 直至如今我依旧记着, 其内容是, 原代细胞并非面团, 你绝不能够用力去揉。
一般而言, 离心速度被控制在二百至三百克之间, 时间为五至八分钟, 倘若转速过高, 且时间过长, 那么细胞膜就会破裂, 这看似是小事, 实则决定了你是否能够拿到活的细胞。
铺板密度为什么要精确
有人说，大概差不多就行。
不行。真的不行。
初代细胞和传代细胞系不同, 它对于细胞之间的接触极为敏感, 若铺得过于密集, 细胞就会出现接触抑制, 无法正常生长, 要是铺得非常稀疏, 细胞会丧失细胞间的信号交流, 进而直接凋亡。
尤其是大鼠的原代神经元，倘若铺板密度出现哪怕极其微小的偏差, 那么最终的结果将会呈现出极大的差异, 有着天壤之别。
一般而言, 我会依据预实验来确立最佳密度的具体数值, 之后实施严格的计数操作。就算多耗费十分钟用于计数, 也绝对不能节省这段时间。
培养箱的环境稳定吗
培养箱的CO2浓度、温度、湿度，每一个都要稳。
有一回, 培养箱的CO2传感器出现了状况, 显示始终为5%, 可实际上已然飙升至8%了。我所饲养的那批大鼠原代肝细胞, pH显著偏向酸性, 培养基变黄的速度特别快, 细胞形态也不正确。
我排查了好几天才找到原因。
故而, 定期对培养箱予以校准, 相较于其他任何事情而言都更为关键。通常情况下, 我会每月借助Fyrite气体分析仪对CO2浓度进行一次实际测量, 随后再将其与培养箱所显示的数值展开对比。要是不进行校准, 那便等同于在进行一场赌博。
换液频率怎么定
有人说一天换一次。
倘若你所饲养的乃是大鼠原代成纤维细胞, 或许不会产生问题。可要是你饲养的是原代神经元, 那么每天更换一次, 细胞将会因应激而陷入崩溃状态。
换液之时, 原代细胞会历经一次温度之剧烈变化, pH 的剧烈变化, 渗透压的剧烈变化。频繁地进行换液, 等同于频繁地折腾它。
我通常依据细胞代谢的速度去做决定, 其一为察看培养基颜色有怎么样的改变, 其二是看pH下降呈现何种速度, 其三是留意细胞处于什么样的状态。倘若状态良好, 那么隔天进行一次更换, 要是状态欠佳, 甚至能够三天都不做更换, 仅仅补充相关液体。
冻存和复苏的陷阱
很多人觉得冻存就是把细胞往液氮里一扔。
大错特错。
在对原代细胞进行冻存操作时, 必须得使用专门用于此的冻存液, 并且, 其冻存时的密度要求相较于传代细胞系而言要更高一些, 我通常会将这个密度控制在每毫升一乘以十的六次方到二乘以十的六次方个细胞的范围内。
复苏之际, 借助37度的水浴方式进行快速融化操作, 紧接着马上予以稀释, 再通过离心手段去除冻存液。此一过程需越快越好, 绝不能使DMSO于室温环境下长时间与细胞相接触。
原代细胞很敏感，DMSO对它的毒性比传代细胞系大得多。
批次差异怎么处理
这个问题可能最让人头疼。
不同批次的大鼠, 其原代细胞有差异, 不同周龄的大鼠, 其原代细胞有差异, 甚至同一只大鼠的不同组织部位, 所分离出来的原代细胞也有差异。
始做之期, 恒为批次差异扰至疑己身于世。此批细胞生长良佳, 彼批则无论如何皆不生长。后吾习得记录之法, 每批细胞之来源, 乃分离之时刻, 其消化所需条件, 以及培养呈现状态, 尽皆记录于册。
半年之后，我就能根据这些记录反推问题出在哪了。
如此写了诸多内容, 实际上归结起来便是一句话: 去培育大鼠原代细胞, 切莫急躁, 切莫偷懒, 切莫凭主观臆断。
每一个细微之处, 皆有可能成为致使细胞崩溃的最终那般极小却关键的因素。然而反之来看, 每一个细微之处倘若妥善予以处理, 那么它亦能够促使你的实验毫无阻碍、顺顺畅畅地持续进行下去。
现在那把培养箱的钥匙，我推门的时候已经没那么害怕了。
但也就是没那么害怕而已。尊重和敬畏，一直都在。
