我真的被气到了。
上次, 实验室进来了一批PCR试剂盒, 其包装看上去颇为高端, 可是之后扩增曲线好似心电图一般怪异。不仅跑不出来Ct值, 而且还耗费了我足足一个星期的时间。
你说气不气人？
之后和几个从事相同行业的人交流, 才发觉这东西里面的情况复杂得很。并非价格越贵质量就越好, 也不是品牌越知名就越值得信赖。我今日就把经历过的那些让人吃亏的事情全部透露出来, 为你们节省一些不必要花费的钱。
PCR试剂盒到底该怎么选？
先搞清楚一个事：你的实验是真的需要它，还是你觉得需要它？
好多人一开始就宣告所谓“我要最为灵敏的”、“我要最为昂贵的”之言。然而你仔细思索一番, 你所测定的那一回基因表达量实际上本就处在并非低的数据状态, 根本就毫无必要去一味追寻超高灵敏度的情况。那无疑就是在白白耗费钱财的行为呀。
我现在的原则是：够用就行。
灵敏度高就一定好吗？
不一定。
咱实验室里有个家伙, 执意要用那种宣称能够检测出单拷贝状况的试剂盒。那后来怎么样了? 其背景噪音大得简直超乎想象, 就连阴性对照都出现起峰的情况了。
太灵敏的东西，有时候反而是麻烦。
你所需要去思考考量的是: 你所拥有的样本的模板量究竟是多少? 你所针对的目的基因的表达丰度又是处于怎样的状况? 要是你的模板量是足够的, 那么普通的灵敏度是完全没有问题的。要是强行去使用高灵敏度, 那只会使得增加非特异性扩增的风险这种情况出现。
稳定性怎么看？
包装上面写的保质期，别太当真。
我见识过好些品牌, 在其刚出厂之际, 各项指标呈现出极为出色的状态, 然而放置不过两个月时间, 便已宣告报废。特别是那些未曾配备独立包装的酶类产品, 经过几次反复的冻融操作之后, 其活性径直严重下降。
怎么判断？
瞅瞅冷链运输, 正规的厂家会采用干冰再加上保温箱, 整个运输过程当中温度所作的记录能够查找, 而那些仅仅只是塞个冰袋从而发出普通快递的情况, 你敢去使用吗?
另有一种土办法, 刚买回来处于起始阶段时, 选取一个已知的存在强阳性特征的样本进行一次测试运行, 记住所得到的Ct值。在过了两个月的时间跨度之后, 再次进行测试运行一回, 对比查看前后两次的情况。要是Ct值往后推移超出了两个循环的幅度, 那么这个牌子所具备的稳定性, 就令人为之忧虑而深感堪忧了。
不同品牌混着用行不行？
千万别。
此绝对是血的惨痛教训, 曾有一回, 我手头某品牌的试剂盒即将用尽, 剩余十几个样本, 遂想着凑合混用另一个牌子的看看情况 , 果然而后数据根本无法令人满意去瞧看, 前后两批跑出来呈现的趋势全然相反。
针对各个品牌而言, 其buffer体系存在差异, 酶浓度并非一样, Mg2+浓度也不尽相同。若强行进行混用, 就如同给自己挖掘坑洞一般。
要么就一次性买够，要么就从头到尾用一个牌子。
怎么判断性价比？
别只看单价。
有些试剂盒, 一管售价为300, 然而仅能够运行25个反应。还有一些试剂盒, 售价是400, 却能够运行100个反应。经过计算, 结果显示后者反倒更为便宜。
还要看效率。
有一些试剂盒, 它的增殖速度是比较缓慢的, 历经60分钟才能够全部完成。而另外一些, 仅仅只要30分钟就可以达成。你来计算一下, 你手中所拥有的样本数量究竟是多少? 难道时间成本就不算是金钱吗?
再者便是重复性这一情况, 存在这样问题的试剂盒, 在十个孔进行检测后, 所得到的 Ct 值, 会出现相差两三个循环的状况, 而有的则能够将差异控制在 0.5 以内, 那些数据不稳定的试剂盒, 即便价格低廉, 但终究是个陷阱, 原因在于你需要耗费额外的时间去重新依次进行验证。
常见问题：大牌就一定好？
不好说。
确实, 国际大牌的试剂盒具备稳定性, 然而价格也在那里明摆着。并且, 有时供货周期较为漫长, 一旦断货, 需要等待一个月。
如今在国内, 存在着一些厂家, 其表现相当不错, 特别是那些最初以给大牌进行代工作为发家起点的厂家。他们所具备的配方以及工艺, 是已然成熟的, 只不过在品牌溢价方面, 并没有达到那么高的程度。
起关键作用的要看两点, 其一为, 他们是不是存在自有研发团队, 其二为, 他们的质控体系是否能够通过考核。
存储和操作有什么讲究？
买回来就扔-20℃的，请举手。
很多人觉着-20℃就没问题了, 实则不然。最好将试剂盒里的各个部分分开装成小分子, 使用几次就取用几份, 剩余的持续冷冻着。防止反复冻融。
再有, 进行操作之际要留意在冰上展开操作, 特别是酶与模板的混合这一情况, 只要温度一旦变高, 非特异性产物便会出现了。
带滤芯的那种枪头必须得用, 为了省钱, 好多人在这一步把它给省略掉了, 结果出现交叉污染的状况, 整块板子全都作废了。
有没有性价比高的推荐？
我不推荐具体牌子，但这个思路你可以借鉴：
首先去查询一番, 这个品牌有没有被同行发表过文章, 要是存在许多高质量的SCI论文对其进行运用, 那么基本上是比较靠谱的。若是如此, 就可以认为该品牌在一定程度上是可靠的。
观摩一下他们的技术支撑团队, 不错的厂商会自行帮你开展预实验, 协助你优化体系, 并非仅仅只负责卖货。
有机会的话不妨试着拿去一些试用装, 大批的厂家怀着乐意的态度供给小包装袋好使你最先进行测试, 倘若使用起来合适了接着去购置大包装的, 要是使用起来不合适也是不会产生亏损的。
总结一句
不是越贵的PCR试剂盒就越好, 也不是越便宜的PCR试剂盒就越有优势。关键在于要对症下药, 即你的实验需要什么样子的, 你就去购买什么样的。
无需遭受那些形形色色诱人广告词的误导, 在实验室这个特定环境当中, 数据才是具备最高可信度最为真实可靠的。
