一、优化洗涤步骤
1、增加洗涤次数与时间
建议洗涤3-5次，每次静置2-3分钟，确保彻底去除未结合物质。
2、改进洗涤液配方
使用含0.05%-0.2%吐温20的PBS/TBS缓冲液，可减少非特异性吸附。
二、封闭条件优化
1、选择合适的封闭剂
推荐5% BSA或脱脂奶粉封闭30分钟以上；若BSA存在交叉反应，可改用0.8%明胶。
2、延长封闭时间
37℃孵育1-2小时或4℃过夜，确保孔板表面完全覆盖。
三、抗体与试剂管理
1、抗体浓度优化
通过棋盘滴定法确定最佳工作浓度，避免过高浓度导致非特异性结合。
2、试剂质量控制
检查显色液是否变质，避免使用过期试剂；不同批号试剂禁止混用。
四、操作规范与设备校准
1、避免交叉污染
使用一次性吸头，拍干时更换吸水纸，防止孔间污染。
2、温控与孵育时间
严格维持37±0.5℃孵育环境，避免温度波动或时间延长。
五、样本处理
1、基质干扰排除
溶血或脂血样本需离心后取上清，或过滤处理。
2、内源性生物素阻断
高生物素样本（如肝素抗凝血）需添加生物素阻断剂。
六、其他措施
微孔板清洁：检测前用75%乙醇清洁板底，避免污渍干扰。
显色控制：严格避光操作，底物反应时间控制在10-15分钟。
通过系统优化上述环节，可显著降低背景信号，提升ELISA的信噪比和重复性。
