身处这一行业长达五年有余，每日都与荧光PCR有所接触，该如何表述呢，此物仿若一名脾气乖张的艺术家。
它并非是那种，只需“咔咔咔”按下按钮，便能够得出结果的，如同傻瓜般简单的机器。你必须要去理解它，还要去哄着它。
没Ct值是怎么回事？
曾经有一回，络绎不绝地进行了三批样本的操作，结果全部呈现为空白状态。那台荧光PCR仪静谧得仿若处于沉睡之中的鱼一般。我目不转睛地凝视着软件界面，其上连一个波浪的迹象都未曾出现过。
后来经过查找才知道，原来是那个热盖没有被压紧，仅仅存在那么一点点的缝隙，最后的扩增竟然直接宣告报废了，你想要去责骂那台仪器，然而它根本就对你不理不睬呀。
这个Ct值呀，说白了呢就是“到底是第几个循环的时候才开始亮起来的指示”，要是亮起来的时间越早，那就表明目标的数量是越多的，要是到了35个循环的时候依旧没有任何动静，那基本上就可以放弃了去休息了。
然而，存在着特殊的情况。在一些样本之中，所含的内容极其稀少，以至于 Ct 值竟然攀升到了 38、40，这与空管的情况几乎没有差别，最终的结果根本无法进行判定。
曲线这么丑，怪我咯？
扩增的曲线呈现出S形，呈现出波浪一样的形状，竟然还有一条如同僵尸心电图那般的直线，每天开启软件就好似在拆盲盒。
标准曲线线性关系不佳
最为令人气愤的是标准曲线，明明心里清楚其理应是呈斜线状的，而且R²大于0.99才算是合格的，然而在实际做出来的时候，它却呈现出的是极其杂乱的样子。
随后学机灵了，在对标准品进行稀释这个操作的时候，选用带有滤芯的枪头来进行，并且不要在冰面上停留过长的时间，因为经过反复冻融的标准品已经发生降解了，就算是神仙来了也没办法挽救回来。
熔解曲线多峰
当熔解曲线未成功做好之际，峰呈现出如同牙齿那样的杂乱无章状态，七零八落。这是因为非特异性扩增所产生的信号在从中作祟，干扰所致。
调配引物浓度花费了一个月时长，温度梯度自55至65，逐一进行尝试，实验记录本之上满是划掉后重新书写的印迹。
食品安全检测的心酸
这一行做的多了，你会发现最累人的不是技术本身。
是那些不知道样本到底有没有问题的时候。
举例来说，进行转基因检测，去跑一回荧光PCR，当TaqMan探针亮起来之际，眼望着扩增曲线终于美妙地上扬起来的时刻，你会在某一瞬间觉着世界着实美好，然而紧接着下一秒，你所要面对的问题便是：此次结果可不可以报出去呢？
和我一同工作的小王，经历过一回，某一种进口的原料，其Ct值为28。标准品的各个梯度，都不存在问题，内参的情况也正常。然而，依据行业标准，这个数值恰好处于灰区。
他在实验室坐了三个小时不敢签字。
之后作出了复测的决定，来来回回历经了四轮，然而结果竟然都在28至29这个区间徘徊，最终还是上报了属于疑似阳性，扣押了那一批货物，上个月市场监管局发布通报，同批次的另外一个供应商的确出现了问题。
倘若这种经历变得繁多起来，那么你便会清晰地知晓，荧光PCR仪是不会进行欺骗蒙蔽的，然而它所察觉到的事物，人们却不一定有勇气去直面。
环境样品是玄学
环境监测更折磨人。
前一年做一项关于水样里特定微生物的检测门类，采集样本是在凌晨三点进行的，放置于冰盒内历经一路，在开展提取核酸操作时，运用磁珠法重复了五次，然而浓度依旧低到令人无奈。
上机完毕后，荧光信号持续不断地在地面上爬行着，Ct值直至36时才好不容易勉强瞧见了一个拐点。
循国标而言，此乃呈弱阳性之状。然而，这般结果，谁人敢予以相信呢？针对质控样所进行的操作，得出的是阴性之态，且空白管亦未出现被污染的情形，那么，问题究竟是出在何处呢？
搜索到最终的结果，是源于水样当中的腐殖酸对扩增反应起到了抑制作用。将其稀释五倍之后再次进行操作，Ct值降低到了32，看起来美观了许多。
那一刻真的想哭。
关于荧光染料的那点事
许许多多的人未曾使用过SYBR Green I，当我首次运用它之际，感觉这个物品着实价格低廉，气味芬芳。
然而，随后察觉到一项问题，那便是它对所有东西都进行染色，就连双链DNA都往里面钻，引物二聚体也被染色，非特异条带同样被染色，所做出的熔解曲线如同山路蜿蜒曲折般复杂，呈十八弯状。
往后，组内人员提议更换TaqMan探针，虽说价格相对较高，然而其特异性良好，无需担忧纷繁复杂的信号干扰。
然而话又说回来，有的时候SYBR Green反倒好用，原因在于你不但能够查看Ct值，而且还能够通过查看熔解曲线来判断产物是否正确。各有各的喜好吧。
要说起这事儿来，还真有点让人觉得好笑，我现如今在包里常常备着一个移液器，还有备用的枪头。有同事询问我，究竟是不是患有强迫症，我回应说并非如此。那是在某一次配制荧光PCR反应液的时候，在20微升的体系当中少添加了一种组分，结果所有的样本全都白做了。
那种惨痛教训，一辈子的心理阴影。
荧光信号为什么采集不到
还有就是，仪器软件里的“荧光通道”经常被设错。
那一回，将SYBR Green当作FAM通道去读取，软件持续示警三个小时“no signal”。我当时还憨傻地对引物、退火温度、镁离子浓度展开排查工作，把所有能够更换的全部更改了一回。
最后的时候发觉，是隔壁那个组的人员在所之前将荧光通道的参数给更改掉了，然而却忘掉把它改回到原来的样子。
你哭笑不得。但没办法，这就是干这行的日常。
凌晨三点的实验室
讲句实实在在的话，荧光PCR检测这个事物，最终比拼的并非技术，而是耐心。
技术是能够去学的，原理是能够通过看书知晓的，然而，那种存在于“明明依据公式计算出来理应是这般的结果，可是偏偏就是要重新运行一遍从而产生的委屈感”，只有经历过的那些人才能够明白呀。
凌晨三点，实验室只剩荧光PCR仪散热风扇转动的嗡嗡声。
其他人都离开了，仅余屏幕上那一行行跳跃着的曲线。在那一瞬间你会思索，这台机器所注视的究竟是什么？是数字吗？是图形吗？
仍然是那一堆，人类凭借肉眼无法看见的，微小得能让人满心作慌的东西，于黑暗之中暴露了行踪。
绿灯这么亮着的时候，我就觉得，这事确实得有人干。
当撰写这一篇内容之际，我个人也不禁笑了起来，自我感到仿佛像是祥林嫂那般，每日都在絮絮叨叨着荧光PCR这一微不足道的事儿。但是要是你来询问我是否后悔呢——我并不后悔。
只是下一次Ct值再晚出来，我真的要把仪器砸了（开个玩笑）。
最后说点实在的
RNA提完之后，在样本处理之前，去测一下浓度。要是纯度不好，那么扩增效率注定要是低的。
设立内部参考的时候一定要记着查看引物设计是不是存在跨越外显子那种情况，不然的话基因组的脱氧核糖核酸就会被扩增出来。
另外，标准曲线之中每个点的Ct值标准差，不可以超过0.2 ，否则线性关系必然不会好 ，这些全都是用血泪教训所换来的。
另外还有这么一点，就是在进行荧光PCR操作的时候，切莫贪图节省相关耗材。那种带有滤芯的枪头，一套的价格其实并不是特别昂贵，要是为了节省它，到头来节省下来的或许只是一周的时间罢了。
说到底，荧光定量PCR这事物并非复杂不堪，然而却着实并非简易至极。它不仅仅是一项技术，更宛如一面镜子，能映照出你的细致之心，你的忍耐恒久之耐心，以及你直面失败时承受内心压力的那份承受能力。
就这样吧。
