今天又要跑荧光定量PCR了。
实验室的黑暗料理，说的就是它。
上个月跑了四块板子，数据飘得我怀疑人生。
三个复孔，Ct值差1.5。
谁懂啊。
把我导师气笑了，说你加样是闭着眼睛加的吗。
累。
到底选SYBR Green还是TaqMan
刚开始接触荧光定量PCR的时候，我以为选了方法就行。
天真了。
SYBR Green便宜啊。
我用它跑了好几个月。
每次都要做溶解曲线。
老师讲道，SYBR Green I是一种染料，它结合于所有dsDNA双螺旋的小沟区域，其在游离状态的时候发出微弱的荧光，而一旦与双链DNA结合以后，荧光便大大增强了。
但正因为这样，引物二聚体也能发光。
有次跑出来一条完美的扩增曲线，我心花怒放。
师兄看了一眼说，你溶解曲线里有俩峰。
引物二聚体，重做吧。
一万头羊驼从我内心跑过。
TaqMan探针法特异性高。
师兄实验室在用，说多重检测很方便。
但设计探针贵啊。
老板要是知道我一天到晚换贵方法，估计得把我锤爆。
那个气死人的引物设计
说引物设计简单的人，肯定没被它坑过。
有段时间不知道咋回事，跑出来的NTC居然有扩增。
水都能扩增，我还能说什么。
排查了好久，最后发现是引物二聚体。
真的是小白中的小白。
后来我学乖了，引物设计的时候仔细看原则：
目的片段的范围被控制在100至300bp ，上下游引物各自的Tm值，当中的差异不会超出1℃ ，GC含量处于40%到60%这个区间内。
这些都得记牢。
内参基因这件事
选不好内参，定量白瞎。
处于指导地位的老师表示，你倘若打算运用相对定量这样一种特定的方法，然后对不一样的样本之中的基因的相对表达方面的差异予以检测，那么便必须挑选恰当合适的内参基因，以此来排除掉误差。
最开始我就用GAPDH。
当中有人告知我，在从事代谢关联实验之际，GAPDH有可能呈现不稳定的状况，因而务必进行验证。
我当时啥也不懂，只盼着结果别太离谱。
还挺幸运，没出事。
后来有篇论文说18S rRNA稳定性好，我就换了。
Ct值确实稳定多了。
实验室，有一个师妹，更为厉害，直接挑选两到三种内参基因，每一种都配置两对引物，然后拿到机器上实测。
她下功夫了，我是真懒。
加样加到手抖
96孔板。
每个孔20微升。
手稍微一抖就完了。
往次进行绝对定量时，标准品梯度设有六个点，当中每个点都具备三个复孔，并且还有样品以及对照。
一块96孔板都不够。
使用已知浓度的标准品来构建标准曲线，以此绘制出浓度跟CT值的对应关系之后，绝对定量才能够计算样本浓度。
意思是得把质粒稀释成10的几次方。
7次方、6次方、5次方、4次方……每次稀释都要换枪头。
稀完还得涡旋混匀。
稀到最后我都不知道哪管是哪管了。
那个总是捣乱的气泡
荧光定量PCR对气泡特别敏感。
一旦有气泡停留在管底，在PCR扩增过程中，随着温度升高，气泡会裂开，进而使得仪器检测到的荧光值突然降低，原因就在于此。
我没少被它害。
有次加完样，看了一眼孔板底部，没气泡。
结果跑出来扩增曲线中间有个向下的尖刺。
重来。
后来师姐告诉我要先离心再上机。
离心几步就解决了。
我居然折腾了一下午。
复孔为什么一定要做三个
实验室内存在着一项未形成文字记录的规定，每一次进行实验的时候，每一个反应都起码要有三个技术方面的重复。
我起初不理解，觉得师兄师姐太小心了。
直至某次跑出数据，三个复孔的Ct值，其一为22.1，其二为24.8，其三为23.2。
标准差超过1了。
师兄看了直摇头。
像这种数据差异太大的情况，根本没法分析表达差异。
为了用期望值当作总体均值的估计，从而消除随机误差，进行了三次技术重复并取均值。
不仅是技术方面的重复，而且还得有生物学重复，起码要有三个相互独立的样本才行。
一篇论文里要是只有单次实验的结果，编辑部都不收。
标准曲线那两个指标
绝对定量的核心命题：标准曲线。
在理想的情形下，R²应当大于或等于0.99，扩增效率需要处于90%至110%的范围之内。
我得说，标准曲线的斜率决定扩增效率。
斜率约在-3.32左右时效率是100%。
有一次我的斜率达到-3.9，效率算下来才80%。
模板浓度不是线性递进，扩增效率太低，数据没法用。
所有样品和梯度得重新跑。
心累。
仪器也欺负我
有段时间，阴性对照老是有扩增曲线。
怀疑污染。
把整个台面擦了好几遍，换了新枪头、新试剂、新耗材。
没用。
后来发现是仪器里那个检测孔坏了。
那个孔的检测不正常，导致每次阴性都出信号。
换了个孔位就好了。
浪费我大量时间。
自那之后，我形成了一种习惯，在进行上机操作之前，会先采用阳性的对照方式，去检查设备所具有的情况以及试剂的情形，确认没有任何问题之后，才会去运行正式的样本。
SYBR Green的溶解曲线玄学
用SYBR Green法最怕溶解曲线不是单峰。
要做溶解曲线分析确认产物特异性。
曾经有一回，我的溶解曲线呈现出双峰的状况，然而目标产物的Tm值差不多为83℃，而引物二聚体的Tm值大约是73℃。
说明引物二聚体影响了结果。
但目的基因表达量很低的时候，引物容易纠缠在一起形成二聚体。
要提高退火温度试试看，或者直接降低引物浓度。
实在不行就用TaqMan探针法吧。
老板的钱包在滴血。
技术重复值为什么会差这么大
在那段时期，数据始终处于不稳定的状态，经过对加样环节进行检查，对稀释过程实施查看，就连枪头型号都予以审视之后，却均未产生任何效用。
后来发觉，乃是整块板子进行加样的时段过于漫长，致使第一批添加的以及最后一批添加的模板已然降解了啊。
时间控制不好，RNA就容易降解。
避免光线照射，在冰面上进行操作，戴上手套，使用没有酶的耗材，做好这些基本的操作，数据的稳定性的确会提升到一个更高的水平。
边缘效应也别小看
孔板边缘的温度和中心有差异。
尤其是边缘孔的Ct值，和中心孔差异明显。
所以点样时尽量让样品孔集中在板子中心区域。
边缘放阴性对照或空白对照就好。
这些小细节不注意，全是坑。
那些总想撞墙的时刻
快跑了好多块板子，差不多快要出结果了，却发觉程序忘掉设置荧光信号采集步骤了。
白跑，重来。
扩增曲线不光滑，信号太弱，提高模板浓度后，重来。
溶解析出的曲线其峰值形态呈现出杂乱无章的状况，这是什么情况呀，明明采用的是探针法居然还出现了熔解曲线不正常的问题？对试剂的配比展开检查，然后重新操作一遍。
熬到晚上九点多，实验室就剩我一个人。
冷不丁把仪器关了，又犹豫着打开。
明天接着跑吧。
荧光定量PCR其实教会我很多
以前不太会在意细节，觉得差不多就行了。
跑了几次qPCR之后，发现求“差不多”只会错到离谱。
准确度有关于加样，温度程序要进行设置，试剂保存以及稀释，对照亦需要设计……没有任何一项能够偷工减料。
现在跑之前会做预实验，看溶解曲线和Ct值在不在正常范围内。
选用镊子将孔板边缘谨慎地拨至中间位置，于其上运用排枪迅速地添加试料，在上机之前再三地核查程序。
当数据处于稳定状态之际，望着那整齐划一的扩增曲线以及呈现单峰形态的溶解曲线，那种成就感绝非其他任何事物所能相媲美的。
谁还没被qPCR伤过呢
今天这块板子跑出来了。
复孔的Ct值分别是：24.21、24.18和24.25。
标准差不大于0.1。
溶解曲线单峰，斜率符合要求。
这感觉就像，熬了好几个夜之后，终于看到结果有朝我要的趋势。
荧光定量PCR就是这样。
坑很多，踩不完。
但是呢，每一回开展之后，总是会增添些许的经验以及感觉，或许这刚好就是它具备趣味的所在哟。
