同事又问我山羊原代细胞怎么养了。
说实话我也没多厉害，只是失败得多了，摸出点经验。
原代这东西，就是直接从动物身上取下来的。
在你拿到它之际，它携带着那只羊的体温，有着那只羊的呼吸，甚至存在着那只羊最后的挣扎。
当每一回从培养箱之中把培养瓶给取出来时，我心里就在思索着，那些细胞可还记得它们处于羊身上时候的模样呢。
细胞长得太慢怎么办
这个问题我遇到过无数次。
培养基不对，它们就给你脸色看。
DMEM/F12属于不错的基础选项，加以添加之10%至15%的胎牛血清。
血清比例别舍不得啊，原代细胞娇贵着呢。
还有人试过20%的血清，嘿，确实长得更快。
别问我为什么知道，我半夜守着培养箱换液都换出强迫症了。
怎么分离山羊原代细胞
常用的无非两种：酶消化法和组织块贴壁法。
酶消化快，但容易伤到细胞。
组织块更温柔，慢慢等它自己爬出来。
就拿皮肤组织来讲，将其剪成小块，加入胶原酶和分散酶混合而成的液体，在37度的水温环境下，放在水上进行摇晃，持续一两个小时。
在中途的时候，需要不定期地进行晃一晃这个动作，肉眼是无法看出来有什么变化的，然而实际上酶正在细胞之间悄悄地咬断连接。
那个过程莫名觉得解压。
山羊原代细胞培养条件
温度37度，CO₂浓度5%，饱和湿度。
听起来简单，实際上步步都要小心。
细胞对于pH该值稍微出现一点儿偏差的情况，就会表现出不高兴的状态，其形态发生了改变，生物体进程下的整体表现是生长速度变得缓慢，甚至直接出现停止生长的状况。
首次换液一般在接种后24到36小时。
别太急着换，让它们先稳稳贴上。
之后每两天换一次，就像给花浇水，得掐着点。
山羊原代细胞传代注意事项
融合度到80%到90%，就可以传了。
用0.25%胰蛋白酶-EDTA，室温下消化一到三分钟。
看到细胞变圆、开始脱落，立刻加血清终止。
我感觉每次消化就像在走钢丝。
早一分钟细胞没分开，晚一分钟细胞就废了。
比例一般1比2或者1比3，传完24小时内别老去动它。
我处于第6代时，细胞毫无缘由开始变圆，并且不贴壁，经过一番长时间查找，才发觉是胰酶消化过度所致。
细胞污染怎么避免
这个几乎是每个养细胞的都經歷过的噩梦。
细菌污染：培养基变黄变浑浊。真菌污染：能看到白色絮状物。
支原体最难发现，因为它太小了，光镜下根本看不到。
细胞也不会明显死掉，只是长得特别慢，形态也变得奇怪。
我曾经养过一株细胞，养了两个月的时间，一直都感觉不太对劲，一直到送去检验，最后才发现是支原体呈阳性。
从那以后，我每个月都做一次支原体检测。
拿着紫外灯对着操作台照射时长为三十分钟，把器械通过高温进行灭菌处理，每一次进行换液操作时要用酒精棉擦拭瓶口。
这些说起来都是常识，但有时候一忙起来就容易偷懒。
千万別偷懒。微生物比你更勤奋。
传代时机怎么把握
细胞融合度超过80%，要传了。
0.25%的胰蛋白酶 - EDTA于37度进行消化，持续两分钟，当看见细胞呈现变圆的状况时，立刻终止该操作。
动作要快，干脆利落，这是我最深的体会。
按1比2比例分瓶，传代后前两次换液格外轻揉。
第3代之后活性最稳。
我自己的经验，山羊原代细胞通常也就能稳定传5到8代。
超过这个数，要么长得越來越慢，要么形态就变了。
所以我都会在早期多冻存一些，以防万一。
山羊原代细胞冻存方法
冻存液用90%胎牛血清加10% DMSO。
冻存管要标记清楚，细胞类型、代数、日期，一样都不能少。
我有着习惯，是好几种冻存方法同时存在，在液氮当中，至少要有三管进行冻存，在冰箱里面，还需要存有两管悬液，可别如同我第一次冻存时那样，仅仅只留下了一管哩。
山羊真皮成纤维细胞系
存在研究采用原代外植与酶消化相结合的方式，并且添加了生长因子，此细胞系现已稳定地传至 56 代以上了。
56代呀，当我听闻这个数字之际，我的首个反应并非是心生佩服之情，而是……他们所拥有的液氮罐必定是极为庞大的。
不过，现在回想起来，能够稳定传代这件事，说明了当时的操作，那是真的严谨，不像我，经常会临时变方案，是这样的情况。
过往之时，我老是觉得，方法并非关键所在，经验才是至关重要的。然而如今，想法已然发生了改变，方法与经验这两者，都是不可或缺的，只是，运气这一方面，同样也是有着重要性的。
山羊口腔上皮细胞
有些研究采取了这样的做法，使用0.1μg/mL的分散酶Ⅱ以及300 U/mL的胶原酶Ⅰ进行组合消化，之后组织经过贴壁48小时，细胞便开始慢慢地爬出来了。
这是个很实用的细节，原代细胞的特性真的取决于你取什麽组织。
口腔上皮、皮肤、肌肉每个地方的来源，培养难度完全不一样。
实际操作的碎碎念
关于取材，一定要新鮮。
组织离开动物身体后，细胞就开始凋亡了，处理得越快越好。
步骤说起来简单：剪碎、加酶、消化、过滤、离心、重悬。
但每一隻山羊的个体差异都能让你抓狂。
同一种酶，这只效果好，换一隻就不行。
他，我的老板，有那么一句话，老是挂在嘴边，那就是，在进行培养之前，得先好好想清楚，每个环节究竟要做些什么。我呀，以前的时候，也同样是如此这般。可如今呢，我却发觉，真正艰难的并非是“知道”这回事，而是“做到”这事。
特别是在进行原代细胞的培养时，仅仅只是相差那么些许的温度，以及那么些许的时间，然而其最终结果却相差得十分遥远。
那你说，我写这些是想让你少走弯路。
但其实有些弯路，走了才能记住。
山羊原代细胞培养的难点总结
要说最大的感受，就是这东西没有完美的标准答案。
同一个操作步骤，换个人做可能就是另一种结果。
所以我现在做实验都会把每一步写得很详细。
哪天做出来了，就知道是哪种方式对的。
如果失败了，也能大概知道哪一步出了问题。
记录真的比记忆靠谱。
我的笔记本，已然用光了五本，每一页之上，都满满黏附着试剂的标签，以及染液干掉之后所留下的痕迹。
有人说原代培养是耐心活，我倒是觉得，不如说是一种自我较劲。
你能跟这些细胞耗多久，它们就给你多少反馈。
传代过程中最怕的是突然的意外，比如消化过度，比如污染。
我老是会在规定前抵达实验室，将全部物品都筹备就绪，遂后朝向空气去演练一回操作流程，被同事碰到过数次，特别尴尬。
不过后来发现他也在这么做。
最后说一个选组织的小经验
皮肤和肌肉是最容易取的，而且不易污染。
如果想长期储存遗传资源，成纤维细胞最合适。
然而我又感觉，皮肤好取归好取，只是成纤维细胞的增殖能力存在限度，最终必定会衰老。刚拿到一个样本之际，总觉得时间极为充裕，转瞬之间细胞已然老化了。
有些事情，现在不做，就真的来不及了。
原来的山羊细胞进行初次培养，大概说来此般情况就是目前我能够达成的，达不到非常出色的地步，不过已然竭尽全力了。
