坐标轴到昨天凌晨一点这个时间点，朝着流式细胞仪展现在屏幕上面那团已经模糊混淆成一片状态的散点图。
我已经看了二十分钟。
三遍进行了染色，细胞是同一批的，三遍所呈现的结果都是相同的，在四色panel里的FITC通道中，阳性群与阴性群几乎快要融合在一起，紧紧地挤成一团，紫色和靛蓝在散点图上混在了一块儿，根本无法区分开来。
我问自己：是滴定没做好？还是克隆号选错了？
还是说，从一开始就不该用直标抗体？
搞科研的人大概都懂这种绝望。有时候问题不在操作上。
流式抗体到底是个啥
带有荧光标记的抗体便是流式抗体，其原理相对简单，抗体去寻找细胞上的目标蛋白，荧光经激光照射后会发光，流式检测细胞仪进而将这个光信号转换为数据。
可道理谁都懂。做起来就是另一回事。
为啥要关注克隆号
我踩过最大的坑，是克隆号。
针对同一靶点的抗体，不同克隆号的性能，会相差出几个数量级呢。我头一回做胞内染色之际，随意买了个 CD4 抗体，结果信号干净得就如同没进行过染色一样，阴性对照和实验组之间，完全没有差别。
往后才晓得，我所购置的那个克隆号识别的是构象表位，在历经固定破膜的处理之后，抗原的结构发生了改变，抗体根本无法识别出目标。
换个克隆号之后，立竿见影。就这么简单。
克隆号存在差异，主要体现于几个方面，其一，识别表位关乎你到底能不能检测到目标抗原，其二，亲和力对极限灵敏度产生影响，其三，交叉反应性决定了结果的干净程度。
荧光配色让我崩溃了好多次
最令我感到头疼不已的是多色流式，所谓多色这一情况，指的是能够同时对多个靶点展开检测，然而你必须要想出相应办法，使得每个荧光团所产生的信号之间不会相互产生干扰。
此时此刻，我正着手进行着5色的panel，已然是颇具复杂性了。有人达成过10色，甚至还有做到18色的，那种量级的配色绝对能够将人逼至疯狂状态。
几个原则是死了好多次换来的教训。
重点在于强弱搭配，我的那次所获教训极为深刻，你将表达量低的目标抗原搭配了一个暗的荧光团，即便抗体已然结合上去，信号却微弱到根本无法读取出来，与之相反，表达量很高的靶点搭配上最强亮的染料，最终的结果便是信号爆表，所有通道都出现了爆炸般的情况。
还得去考虑光谱重叠方面的问题，PE以及PE - Cy5的光谱重叠程度是相当大的，不论怎么去调整补偿，都使得其无法清理干净。我当下进行多色操作时，第一步便是要打开光谱查看器，逐个去扫描存在重叠的情况。
另外还有一件事情，多色的方案并非一次就能够完成搞定的。你必须要反复地去滴定每一种抗体，依据细胞分群所得到的结果持续不断地进行调整优化。
做滴定不是浪费时间
提到滴定，很多人觉得浪费时间。
何为滴定呢，是设定若干个浓度梯度，将抗体从低浓度开始达成饱和浓度这般来做，查看细胞分群的效果。
浓度处于较低水平时，信号变得微弱，那些低表达的抗原根本就检测不出来；当浓度处于较高水平时，非特异性结合急剧升高，背景脏污到了极其严重的程度，阳性群体与阴性群体混合到一起根本无法区分清楚。
这个平衡点找对了，结果质的飞跃。
对于滴定效果的评估，我始终运用染色指数，其公式为（阳性群中值减去阴性群中值）除以（2倍阴性群的标准差），虽说听起来繁杂，实际上就是查看阴阳群分开的程度。
一次滴定，的确是要耗费几个小时的时间，然而，依据我的经验来讲，那是投入之中性价比最高的，不存在其他可与之相比的情况，不会有第二个这样的情况了。
选抗体要四步走
选适合实验的抗体，最好按四步走。
首先，要进行的是确认样本种属以及靶标，倘若抗体所选择的种属出现错误，那么不管拥有再多的经验，都是无法挽救回来的。在种属被正确选择之后，接下来还需要去确认靶标的表达位置，也就是到底是表面还是胞内。而对于胞内靶标而言，是需要进行固定破膜处理的，这种操作相对来说会更加麻烦一些。
第二步：查看克隆号，不同的克隆号，其检测效果存在着很大的差别，最好先去查阅文献，看看同行所使用的究竟是什么？
第三步，进行荧光标记的选择，这个选择要依据流式细胞仪的配置来开展，其中激光以及滤光片会对哪些荧光能够被使用起到决定性作用，要是进行多色操作，那么荧光团的兼容性则是首先需要予以考虑的事项。
第四步：进行同型对照，这算得上是一种阴性对照，其目的在于将抗体与细胞表面的非特异性结合给排除掉。
一直在犯错的路上
有一次，我同时做八种细胞的免疫分型，试剂配错了两种。
结果吗？全部重来，耽误了整整一周。
又有一回，细胞染色已然全部完成，等到上机之际，才发觉死活染料未曾添加进去。死细胞所具有的自发荧光程度颇高，根本没办法去区分真实存在的信号以及背景噪音。那一整个板的标本算是作废了。
如今，每开展一回实验，我都会将每个步骤的关键要点记录于旁边，涵盖抗体稀释比例、孵育时长以及洗涤次数。并非缘于我记性欠佳，而是因为我着实对自己缺乏信任。
做流式就是这样。每一步都是小陷阱。
做流式的过程，有时候更像是在和自己的健忘、粗心、侥幸心理作斗争。
日前那个折戟的panel，于今日我再度去做了。将衰弱的荧光团替换成了更为明亮的，又重新调试了补偿。
显示结果的那一刻——散点图终于有了我想要的分群。
阳性群和阴性群划出了清晰的界限，四个通道的信号干净得发亮。
松了口气。
这种时候，你就会觉得折腾这么久，还是值得的。
要是你同样在进行流式相关操作，那就不可以仅仅光顾着看靶点，不能去把克隆号给忽视掉，你所购置的抗体必定得经过验证，证实是适用于流式（FC）[15†L12]具体情况的。
说实话，谁没踩过坑呢？但下一次，也许能少踩两个。
也许吧。
