这东西真的会把人逼疯。
做了三次，曲线的斜率都不对。
人家说你的熔解曲线怎么跟狗啃的似的，我笑不出来。
为什么我的荧光定量PCR总是不特异
引物设计那会儿，感觉自己挺认真的。
前往NCBI去扒序列，将其在Primer - BLAST上跑上一遍，结果发现Tm值也卡在了60度上下。
结果跑出来的熔解曲线，两个峰。妥妥的双胞胎。
随后才弄清楚，设计完成之后还得进行验证，要对cDNA进行5倍梯度稀释，扩增效率达到90%直至110%才算是通过。
斜率应该在-3.1到-3.6之间。
R²要大于0.99。
这些数字我当初一个都没测。
荧光定量PCR到底该选染料法还是探针法
两种我都用过了。
SYBR Green价格低廉，恰似实验室人员较为倾向的了选择——旨在尽可能节省开支，是能够节省便节省的那种了。
但它不挑食，哪个双链DNA都发光。
引物二聚体、非特异性扩增，统统给你当成宝。
非要跑熔解曲线验证，单峰的才能用。
TaqMan贵。
探针一合成，钱包就薄一层。
但特异性和灵敏度确实好，能低到10拷贝。
追求精准的话，还是咬牙上了。
Ct值总是在35以后才出来
这个坑我踩了不止一回。
你的退火温度太高，引物和模板死活对不上。
或者——你的模板就是不行。
抑制剂在里面捣乱。
酚、乙醇、肝素，什么都可能有。
样品提纯的时候多上点心吧。
熔解曲线分析其实没那么玄
单峰尖锐，万事大吉。
双峰或多峰，完了。
引物存在特异性欠佳的情况，退火温度出现不正确的状况，模板遭受到基因组 DNA 污染，这些都存在可能性。
检查引物的TM值，上下游最好差不超过2度。
试试调高退火温度，非特性扩增可能会消失。
阴性对照跑出来也有峰的话，基本就是引物二聚体没跑了。
荧光定量PCR能干什么
基因表达量，最基础的。
我一般用ΔΔCt法算倍数变化，内参基因校正样本差异。
环境样品里的微生物也行。
有的团队在文献当中，运用这个来检测水源里的致病微生物，其敏感度挺好，速度也不错。
多重荧光定量PCR好像挺厉害
以前觉得一个管最多能测五六个靶标就得烧高香了。
现在技术不一样了。
有人用荧光通道编码，一管几十上百个靶标都不在话下。
如同MeltArray，就是厦门大学所做的那家，单个管子能够测量72个靶标。
缺点是设备要求高，成本也上去了。
看你的实验目的是什么吧。
我的非特异性扩增是怎么解决的
重新设计了引物。
也许之前的序列，是跨内含子设计没弄妥当，基因组DNA一块儿被扩增了。
退火温度提高2度，双峰立刻变单峰。
加了热启动酶之后，背景噪音小了很多。
该试的方法都试了。
现在我的曲线总算顺眼了。
Ct值落在20到25之间，内参稳定，重复孔的CV值<2%。
下午，当看见了数据，在该时段，实验室里仅余我自己，我竟然对着屏幕持续笑了五分钟。
可能你也经历过这种时刻。
做了诸般难以留意的优化，历经无数回，到了最后那一组数据呈现出来的刹那，那个极短的瞬间，这时你立刻就会明白，这一切都是正确无误的，是对的。
这种快乐，大概只有搞技术的人自己明白。
qPCR只是工具箱里的一把螺丝刀。
关键是你要拿着它去拧什么螺丝。
