今天不聊复杂的原理，就想说说我整天捣鼓的荧光PCR检测。
每一次，当我站立于这台荧光定量PCR仪跟前的时候，我都会觉着它宛如一名毫无情感的考官。
盯着屏幕上那些彩色曲线，能盯着看十分钟，总觉得它在嘲笑我。
上周跑的数据又飘了，三个复孔的Ct值差了1.5。
群里有人说：你这技术是做不了科研了。
用染料还是探针
刚接触的时候，觉得SYBR Green便宜，真心便宜。
加个染料就能跑，还要啥自行车。
结果呢，假阳性搞得我头大。
一种名为引物二聚体的东西，实在是极其可恶，它竟然具备能够发光的特性，随后在溶解曲线方面，就给弄出了两个峰。
师兄过来瞟了一眼说：你这背景太脏了，重做吧。
我当场就想把96孔板给摔了，一万个念头在脑子里打转。
后来导师委婉地说：你要不试试TaqMan探针？
好用是好用，特异性高。
但那玩意贵啊，一百多块钱一个反应。
若老板晓得我每回都使用这般昂贵的试剂，想来会将实验经费给我削减一半。
引物设计没那么简单
说起引物设计这件事，真的能气得睡不着觉。
有段时间NTC居然有扩增。
什么概念，水都能扩增。
我一度以为自己是个天才。
后来发现是引物二聚体搞的鬼。
真是最基础的错误。
再后来我学乖了，拿个小本本把这些全记下来：
目的片段控制在一百到三百bp之间。
上下游引物的Tm值相差不要超过一度。
GC含量保持在百分之四十到六十。
内参基因选不准，全都白瞎
刚入行的时候只知道用GAPDH。
觉得大家都用这个，我也用，准没毛病。
后来有一次跑出来的标准化数据特别奇怪。
一个师姐问我：你做的是代谢相关的？
这个情况下GAPDH有可能不稳定，你验证过吗？
我当时心说，啥，GAPDH还会不稳定？
验证个屁啊，我不知道。
辛辛苦苦做了好几天，想死的心都有了。
后来听论文说18S rRNA稳定，我赶紧换了。
嗯，确实稳定了一些。
就是在实验室里，有个师妹，她更厉害，直接挑选了两到三个内参，每一单个都去配引物，并且还前往机器那里实际测试，看哪一个最为稳定。
这才是正经做课题的。
我是真懒。
96孔板加样，手抖是大概率事件
每个孔20微升。
就那么一点点，枪头按下去的时候，指纹都在发抖。
上次做标准曲线，设置了六个梯度，每个梯度三个复孔。
还有样品，还有对照。
一块96孔板差点不够。
7次方、6次方……每个稀释梯度要换枪头，还要涡旋混匀。
最后我都不知道哪管是哪管了。
做了一下午，头眼花缭乱。
气泡这个小恶魔
荧光pcr检测对气泡特别敏感，我之前根本不知道。
有一次加完样，底部看起来特别清澈，啥也没有。
结果跑出来扩增曲线中间有个向下的尖刺。
就像心电图突然停了，但是又翘起来了。
搞不懂为什么。
重启机器重跑，问题一样。
后来一个师姐过来瞅了一眼：你没离心，这有气泡。
离个心能解决的事，我折腾了一整个下午。
做实验就是这样，折磨你没商量。
最怕的，跑完以后啥也没
做荧光定量PCR检测最怕什么？
最怕跑完一批，板子拆出来，发现全是直线。
荧光信号没变化，扩增曲线没反应。
Cq值根本不给算。
看着那些平平的线，大脑一片空白。
又想是不是哪个试剂出问题了，又想是不是机器坏掉了。
再度核查加样记录，发觉存在一处七管六管的地方，少添加了某样物品，又或是忘掉进行混匀的操作了。
有时候什么都检查不出来，只能硬着头皮再来。
就像往大海里扔一个石子，只听”咕咚“一声。
然后毫无反应。
实验室那些大神有时候也说：这个东西就是玄学。
好的时候特别顺。
差的时候，做什么错什么。
不过客观讲，荧光pcr检测是有用的技术。
灵敏度高，特异性强，几十个拷贝的DNA分子也能被抓到。
不然这技术也不会用这么多年了。
三个复孔为什么永远要这么多
为什么做荧光检测的时候一定要三个复孔？
我一开始不懂。
觉得那些有经验的师弟师妹太小心了。
后来有一次跑出来，数据是这样的：
第一个孔Ct值是22.1。
第二个孔是24.8。
第三个孔是23.2。
标准差直接超过了一。
这次我自己摇头。
因为再信誓旦旦地说这是实验误差，自己都骗不了自己。
没办法，只能把板子取出，再度进行加样操作，再次跑起来，再次折腾一番，接着持续重复做。
做实验，最折磨的就是这种无力感。
一些别的
荧光定量PCR技术在实验室太常见了。
好似实验室之中习以为常的常见之事，然而你始终无从晓得这顿饭会遭遇何种意料之外的情况。
它最为厉害之处在于，灵敏度是极高的，哪怕反应体系里仅仅只有几个拷贝，也是能够被检测出来的。
但同时这玩意极度娇贵。
荧光PCR检测的流程并非繁杂，存在五个具有显著区分的大环节，其一为样本提取，其二是引物以及探针技术运用，其三是PCR反应过程，其四是荧光实时收集工作，最后一项则是数据分析环节。
但每一步都是坑，掉一个都会毁了好几天的结果。
好多时候，弄不明白为何会失败，向好多人询问之后，依旧不清楚。做过多回实验后，才会明白，有时的确是不存在缘由的，再怎么严谨进行操作，也抵御不住某种微妙的、无法控制的状况。
写在最后
或许全部的检测手段，致使你在前期心生烦恼，于中期陷入崩溃，至后期不禁落泪，然而最终却莫名其妙地产生了些许成就感。
对于荧光pcr检测而言，它属于分子生物学领域当中具有革命性意义的技术，其具备能够实时监测荧光信号的特性，还可以精确量化靶基因。
这些我当然知道。
但依然觉得它让人又爱又恨。
将一批板子做完，之后安安静静地跑完，此时数据呈现出整整齐齐的状态。就在那一刻，真的是挺棒的。
希望你看到荧屏亮起来的时候，结果漂亮。
希望你的扩增曲线长得好。
希望你的Ct值别乱飘。
期望跟你一同开展实践的那种人生呀，恰似你所拥有的样本那般，一回回皆绝对不可以出现丝毫差错呢。
