打从进了实验室那天起，师兄就告诉我：QPCR，入门的坎儿。
别的方面我一概都不明白，仅仅清楚这是一项能够致使DNA呈现出荧光的技术，器具一边持续行进着，你就在那里眼巴巴地瞅着红线不断往上升高。
真的，像极了在产房外面等老婆生孩子的心情。
然而问题在于，你守着摇篮旁边待着一整天瞧着它来回晃动，它既不哭啼、亦不吵闹、更不言语，产出了一堆数据，我们还得自行去哄它。
会哭的宝宝有奶吃，会拐弯的曲线才叫人生。
崩溃，究竟选染料还是探针？
一开始着手做qPCR的时候，令人头疼不已的首个问题出现了，那就是：到底是选择SYBR Green呢，还是选择TaqMan呢？
SYBR便宜啊。像去菜市场买大白菜，两块钱一斤管够。
缺点究竟是什么？只要在PCR当中出现了双链DNA，那么它就会去挂上去从而发出荧光。引物二聚体的状况如何？它会挂上去。非特异性扩增产物的情况又是怎样？它依旧会挂上去。
于是乎，你便唯有去依靠熔解曲线这一仅存的希望了。出现多轮峰？那就重新做。存在引物二聚体的情况？同样重新做。
TaqMan价格高昂，然而具备可靠性。探针好似唯有佩戴专用身份证之后才能够进入，门卫对那个密码坚信不二，只要不是与之对应的靶标定然不放行。
钱包会疼，然而数据好似一个行为端正之人。适宜于进行定量的工作，像是绝对定量，检测低拷贝的靶子之类的。
你做之前先想想：预算够不够，容不容易在引物设计上抄近道。
我最怕的不是做实验，是看CT值
每次出结果，盯住那个小角落，看 CT值。
CT值越往左（越小），说明最初放进管子里的DNA越多。
因而你会钟情于小CT，惧怕大CT。比如说，当CT超过38之时，心跳就会急剧加快，脑袋瞬间嗡的一下：糟糕糟糕，没有东西能够扩展了，全是做的无用功。
所以便着手于脑海之中进行复盘，此情形是扩增效率偏低？退火温度应为降低之态？镁离子的量尚不足够？或是引物的状态比较虚浮？亦或是反转录之时cDNA的产出效率极其糟糕？
结果往往就是结论：你失败了，或者你差点失败，全得推倒重来。
CT 值犹如你于烧烤摊位处等待的那串腰子，时间得以延长，愈发表明肉快要不新鲜了。
好好扩着，溶解曲线咋就双峰了？
还有一种死法：看熔解曲线。
单峰，谢天谢地。恭喜你，PCR产物单一。
双峰，甚至如同臭袜子那般模样的多峰，这下可糟了，出现了非特异性扩增，或者是那可恶的引物二聚体。
有时候你以为自己上天了，结果上了鬼船。
于此际，需缓缓来排查，有无引物设计之中的问题，退火温度是否曾做过调整，是否存在基因组 DNA 污染的状况呢？
运气好，梯度PCR能解决问题。运气不好，扔掉引物重新设计。
最让人痛苦的情形是下：你认为试剂盒不存在问题，环境感觉也没有问题，就连DNA模板都是新鲜且醇厚的，可是它偏偏就是让人感觉恶心，就是双峰这种情况。
所以有一种科学叫：大仙作法。
为什么同样的加样，它就是不重复？
我做过两次同样的样品，CT值差了三五倍。
重复性差到想删掉电脑里所有的数据，直接躺平。
坑在哪里？加样误差、气泡、温度板不平、管子材质不够好。
因此要玩qPCR，你得是个有着“强迫症”特质的人，移液器要定期校准，每个样品都要设置三个技术重复。
也要谨慎留意：加样的顺序不能够出现差错，最为常见且广泛的经验是——按照体积所占比例从大到小的次序去添加组分，最终再添加模板。
留意着，添加模板之际，千万不要在试剂区域佩戴同一双手套四处触摸。否则你的Mix马上会被气溶胶彻底搞砸，使样本遭受污染，CT值立刻变为负无穷。
我真正喜欢qPCR的地方
即便吐槽了这般诸多，可我却不得不予以承认，qPCR将老式普通PCR的电泳跑胶给干掉了。
现在，你无需再去打开那管盖，不必忧心紫外看胶会将眼睛照瞎，整个过程都是闭管检测，依靠的是机器实实在在地为你即时给出曲线成果，不存在最后还需猜测的情况，是这样的。
此外，它在玩法方面较为多样：能够用于计算绝对量，借助标准曲线，从而算出初始拷贝数；还能够进行相对定量，运用ΔΔCt法，进而得出基因表达量差异。
这个绝招具备各种功能，能够进行基因表达差异分析，能够开展转基因鉴定，甚至还可以对病原体含量进行评估。
你扭转过脑袋去瞧一瞧，它已然是从科研圈子边缘的人物摇身一变成为占据C位的备受瞩目的爱豆了。哎。技术的进步实际上就是技术领域的一种类似给人镀上一层金色光彩的情况呀。
血的教训：配液区不能混加模板
前面已经说了，再唠叨一次吧。
实际状况是这般：取了一管经由自己精心提取而得的RNA反转录产物，配好了Mix，径直用双手在加样区胡乱点，手指带起一点儿微小液滴，致使整个工作台的管子被污染了。
第二天，阴性对照居然Ct值比阳性对照还小。
师姐朝着你那呈现出惊恐状态的小眼神看了一下，叹了一口气说道，孩子呀，往后加完模板之后一定不要忘记对桌面进行消毒处理，把手套替换，而且移液器所有的，在配液区放置一套以及在加样板区要放置一套。
你点头如捣蒜。
那一刻，科研给予了我番别的启示，首要一个层面蕴含着科学已然的事象，紧接着另外一个层面体现为针对耗费光阴状况的自我审察。
小试剂里的大秘密：引物才是灵魂
引物这种东西，长度在十八至二十五碱基对数就可以，鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例在百分之四十至百分之六十。不要出现连续一样的碱基，不能够转瞬之间变成二级结构进而形成发夹。
不能被设计出来的引物，不论怎样做优化都是没有啥作用的。你要是强行坚持那就会跟我一样，每天处于对人生有着怀疑心理的状况之中——怀疑自身并非是那种从事调研工作的合适料子。
一大把线上设计工具存在着，NCBI Primer - BLAST便是其中之一，输入一个基因号就能知晓最优的引物了。然而，它并不一定是可靠的，原因在于，你需要使得产物跨越外显子连接区，以此来避免将基因组DNA错误地当作cDNA进行扩增了。
细微之处极致呈现，后来终于是瞧见了熔解曲线呈现出单峰的情况，CT值稳稳地处于15之数直到25这个区间那刻，你内心会涌起想哭的冲动。
我有时候觉得，科研中的泪点，比情歌还低。
到底该怎么选qPCR仪器？
上辈子是富二代，直接一步到位搞高通的。
若没钱该如何呢？退一步去寻求较次一等的，寻觅那种只要不是经常容易出现损坏情况的，并且扩增整个过程中热盖能十分有效给力的，还有荧光采集系统处于稳定状态的物品。
品牌不少：赛默飞、ABI、天隆、杰莱美，看你咋预算。
当年我们实验室处于资金匮乏状态，购置了一台二手设备，在运行至第26回合循环之际，热盖出现松动情况，致使大量液体蒸发缺失。次日清晨抵达实验室发现，扩增曲线呈现出如同心电图那般上下剧烈波动的态势。
我捂着胸口，感觉CT值比我心跳还快。
结束语（不，是没有结束）
写着写着，发现要说的太多了。
荧光定量PCR这东西，就像一个脾气很大的情人。
你得小心伺候，有耐心，知道它的每一个雷区，还得有点运气。
但它给的数据是真的让人上瘾。
如果你想入坑，做好和我一样摸爬滚打的准备吧。
挺住。
别哭。
下次凝胶电泳，你记得别跑反了方向。
