说真的，我第一次接触荧光定量PCR的时候，整个人是懵的。
就在那个时候, 我还处于在实验室干杂活的阶段, 师兄随手抛给我一管样品, 然后说道“去进行一回qPCR”, 此后我凝视着仪器屏幕上那一堆杂乱的曲线, 我的脑子里充斥的全部都是疑惑的问号。
后来才知道，这东西不是玄学。
它是在PCR的基础之上添加了荧光染料或者探针, 每进行一轮扩增就会记录一次荧光信号, 如此一来你无需等待跑完胶才知晓结果, 而是能够在实时状态下看着DNA是怎样一点点增多的。
听起来很简单对吧？
但真正的东西，藏在那个“Ct值”里。
Ct值到底是什么鬼？
Ct值，就是荧光信号达到阈值需要的循环数。
简单来说, 要是样品之中目标DNA的数量越多, 那么荧光信号就会越早被发现检测到, 其Ct值也就会越小。与之相反, 要是样品里面的基因数量过少, 那就需要反复循环许多次才能够看见信号, 其Ct值便会越大。
很多人觉得Ct值越小越好，这是对的，但也不完全对。
小到一定程度，你得怀疑是不是污染了。
大到一定程度，你得怀疑是不是扩增效率不行。
这东西就像做饭——火太大糊了，火太小夹生。
令人最为头疼的是, 不同的那些仪器, 不同的各类试剂, 不同的各个实验室所做出的Ct值, 根本就不能够直接去进行比较。
你宣称你Ct等于25, 我陈述我Ct等于27, 究竟谁的样品更为“强”呢, 这取决于你的基线设定于何处, 阈值线绘制于哪里, 得看这些情况。
我曾经为了这两个参数，跟同事吵了一下午。
为什么你的扩增曲线总是奇形怪状？
最让我见过离谱的曲线, 如此形状呈现：起初是平平的态势, 紧接着猛地快速上涨, 随后又降了下来, 之后再度涨了上去。
这是什么鬼？
大概率是非特异性扩增。
该引物的设计存在欠佳之处, 要么退火温度未得到良好优化, 要么当属模板内含有杂质。
解决办法也很简单：换引物、调温度、纯化模板。
但最难的是，有时候你明明所有条件都对，曲线还是不好看。
这时候，你可能需要怀疑你的荧光染料。
SYBR Green此物很价廉, 然而它不挑拣食物, 任何双链DNA皆结合。要是你扩增产生了非特异性产物, 它同样会发出信号。
TaqMan探针好一些，特异性更强，但贵啊。
于是乎, 好多实验室出于节省费用考量, 仍旧使用SYBR Green, 过后拿出更多的时间展开体系优化。
说到底，仪器只是工具，真正决定结果的是操作的人。
荧光定量PCR的坑，我踩过的都在这了
第一个坑：加样误差。
你试着去想象, 存在着这样一个反应体系, 该体系是20微升 , 然后, 你运用移液枪往其中加入2微升模板。
手抖一下，可能就多加了0.5微升。
重复孔之间的Ct值差异直接上天。
所以做qPCR，一定要做重复，至少三个复孔。
第二个坑：RNA质量。
如果你做的是RT-qPCR，RNA的质量直接决定结果。
RNA降解了，Ct值会飘得你怀疑人生。
怎么样去对RNA是否良好予以判断呢, 是通过跑胶来查看条带, 又或者是运用Nanodrop去测量OD值。
说实话, 跑胶是极直观的, 28S条带清晰, 18S条带也清晰, 二者比值接近2比1, 这表明RNA状况还挺好。
第三个坑：内参选择。
内参选错了，所有数据都是废的。
常用的是GAPDH、β-actin、18S rRNA。
但不同组织、不同处理条件下，这些内参的表达水平可能会变化。
所以最好的办法是做预实验，验证一下你的内参稳不稳定。
我曾目睹有人径直采用GAPDH的情况, 结果实验组呈现出与对照组表达差异极为显著的状况, 而后经发现得知是GAPDH自身发生了变化。
白白浪费了两个月的实验。
数据怎么分析才靠谱？
很多人做完qPCR，直接算个2^-ΔΔCt就完事了。
但这东西有个前提：你的扩增效率必须接近100%。
怎么判断效率？做标准曲线。
梯度稀释你的模板，跑qPCR，看斜率。
斜率在-3.3左右，说明效率接近100%。
如果斜率偏离太多，你的数据就不太可信了。
还有，绝对定量和相对定量是两个概念。
标准曲线是通过使用已知浓度的标准品来制作以便实现绝对定量, 凭借该标准曲线进而算出所测样品里的拷贝数。
相对定量是比较样品之间的表达差异，用2^-ΔΔCt。
大部分科研场景用相对定量就够了。
可是, 要是你有需求去晓得确切的拷贝数量, 举例来说进行病毒载量的检测, 那么这就必须要开展绝对定量。
说起来容易做起来难。
标准品不是你想做就能做好的。
浓度算错一点点，后面全错。
写在最后，关于那些不出结果的夜晚
我记得有一次，连续三周跑qPCR都跑不出理想的曲线。
曲线要么飘，要么没信号，要么奇形怪状。
换了引物、换了酶、换了仪器，都不行。
最后发现，是水的问题。
超纯水放太久，长了菌。
换了新水，一切正常。
做实验就是这样，很多时候不是技术不行，而是细节没注意。
荧光定量PCR是个好东西，但它不是万能的。
它会给你数据, 然而你能不能解说那些数据呢, 这靠的是你对于实验原理的领会, 对于细节的掌控, 对于结果的诚信。
有时候，失败的结果比成功的结果更有价值。
由于它迫使你回过头去查验每一个环节, 则逼迫你切实弄明白你正在做的是什么。
这不是鸡汤。
这是我在那些跑不出曲线的深夜里，用咖啡和黑眼圈换来的教训。
