老实讲, 首个接触“荧光定量PCR”这五个字之际, 脑海中浮现的是: 又是哪一实验领域的资深人士想出的晦涩术语呢? 随后因论文给逼到了绝境, 鼓起勇气去查找资料, 然而越看却越发困惑了。
但你猜怎么着？
在我总算切实搞清楚它究竟是做什么的之后, 那种感受如同——你压根儿一直认定某个明星极为高冷, 然而最终发觉他私底下完全是个热衷于逗弄猫咪的憨态可掬之人。荧光定量PCR便是那样的事物。
这玩意到底解决什么问题？
其实, 传统PCR所涉及的, 实际上就是个“存在与否”的状况。你去进行跑胶操作, 当发觉条带变亮的时候, 嗯, 这说明有这样一种物质存在。然而, 它具体有多少数量? 并不清楚。
仿佛你向一位友人发问“你有钱不? ”, 其回应“有”, 然而你并不清楚他兜里究竟是十块钱, 亦或是一亿。
荧光定量PCR可不是这样, 它会向你传达这样的信息: 不但拥有钱财, 并且确切知晓钱财的具体数额。到底是十块钱, 还是能达到一个亿, 能明晰彻查, 毫厘不爽。
为啥叫“荧光定量”？
这名字起得有点偷懒但其实很直白。
简而言之, 是向反应体系之中添加了一种能够发光的染料或者探针, DNA每进行一轮复制, 荧光信号便会增强一些, 机器恰似一个如同偷窥狂般的存在, 全程目不转睛地注视着这个荧光信号的变化。
往后, 软件会依据荧光涨起来时呈现出的“快慢”状况, 反过来推断你最初加进去的模板数量究竟有多少。
听起来是不是也没那么玄乎？
实验最怕什么？
记得当年初次进行荧光定量PCR时, 内心紧张不已, 双手颤抖得如同筛糠一般, 十分厉害。
担忧添加样本出现 Error, 畏惧样本无端被污染, 惶恐扩增曲线呈现类似心电图的态势——起伏不定好似心电图上蹿下跳的那般。
后来遭到师兄一顿指责, 他讲啥呢: “你究竟在惧怕什么呀? 这仪器的智能程度可是高于你的。你只需要将样品添加正确, 其余相关的计算它会帮你完成的。”。
话是这么说。
真得相信呀, 做荧光定量PCR时, 最大的坑并非仪器的问题, 竟然是你的手。
倘若操作不符合规范, 那么所产生的结果便会是成为废数据, 而废数据所表达的含义是, 你需要再次去提取RNA, 再次进行反转录, 再次安排板, 再次添加样本, 然后还得再等待两个小时。
一天就搭进去了。
怎么避免翻车？
实话说，没有谁能保证百分之百不翻车。但有几点是真的管用：
冰上操作。别偷懒。RNA酶无处不在，你打个喷嚏样品就没了。
枪头得精准无误, 千万别选用那种价格低廉且并未校准的枪头, 哪怕其相差仅仅零点几微升, CT 值却能够相差多达好几个循环呢。
制造出三个重复的孔, 莫要嫌弃麻烦之事, 将这三个重复的孔求取平均值, 倘若其中有哪一个孔添加失误了, 如此你便还能够挽救回来。
引物设计可别胡乱弄, TM值, GC含量, 发夹结构, 这些参数看起来令人厌烦, 然而你若是不看它们, 它们可不是什么好相与的, 会给你点颜色瞧瞧, 让你知道不重视它们的后果。
数据怎么看才不懵？
拿到扩增曲线和熔解曲线的时候，很多人第一反应是：这啥玩意？
来观察扩增曲线，去判断它究竟是不是呈现出S型的；那种标准的S型, 意味着扩增的状态是正常的；要是出现的是一条平平的线, 那么不是没添加模板, 就是引物存在问题不行的。
那熔解曲线是怎样的, 可以通过观看峰来知晓。若呈现单峰, 这表明特异性良好, 要是出现双峰, 你可就得打起十二分精神在意了, 这有可能存在非特异性扩增的情况, 也说不定是引物二聚体所导致的。
存在另外一种情形, CT值特别大, 像是超过35。别急于因以为“检测出来了”而暗自欣喜, 要先思索一下会不会是受到了污染。
讲真的, 这般“临界值”的那些数据, 着实是最叫人愁眉不展的。你讲它算作阳性这方面, 却没足够的底气；你讲它算作阴性这方面, 心里又着实不情愿。
不同仪器差别大吗？
这个问题好多人问过。
毫无疑问是存在差别的, ABI、Bio-Rad、Roche, 每一家都持有自身独特的算法以及软件, 然而实事求是来讲, 只要你在操作时遵循规范, 不同仪器呈现出的结果趋势是相同的。
真正影响结果的是你的试剂和引物。
别省钱买便宜的试剂。一分钱一分货，在PCR这块是真的。
引物的设计, 那可是尤为关键。存在一些人, 他们倾向于借助软件来自动进行设计, 然而, 我的一番建议是, 你还是亲自去瞧一下序列较为妥当。毕竟, 软件在一定状况下, 是有可能出现失误的。
荧光定量PCR到底难不难？
说实话，上手不难。
难得的是, 你做出了一个漂亮的数据, 扩增曲线呈现出整齐的状态, 熔解曲线呈现出单峰的形态, 复孔之间的CT值相差不超过0.5, 标准曲线的R²大于0.99。
那种成就感，不亚于你第一次炒菜没糊。
但翻车这种情况也是时常会发生的事 , 也曾有过做一整个96孔板 , 结果全部都没有扩增成功的经历 , 那时真的特别想把枪给摔了 , 后来经过检查得知是反转录这个环节操作时加错了所需的酶。
这种事，谁还没经历过呢？
最后说点实在的
荧光定量PCR此物, 你做得越多, 便越会觉着它仿若一位老友。其脾气稍有怪异, 然而你若摸透了它的秉性, 它便会乖乖听从你的。
别怕犯错。实验嘛，本来就是试错的过程。
唯一需要铭记的一点在于, 要以认真的态度去对待每一个步骤, 千万不要偷懒, 也不要凑合着了事。
数据不会骗人，但你得先对得起数据。
弄出这么多内容, 实际上就是想要跟你讲: 这个东西真的并非那般令人畏惧, 沉下心去开展相关行动, 倘若行动的行为有成效, 则你亦具有达成目标的能力。
