实实在在讲, 我才踏入实验室那段时间, 最害怕的并非是进行跑胶操作, 不是开展转膜流程, 而是——二抗。
深思熟虑一番, 一抗挑选耗费诸多时间许久, 价位高昂至极, 孵育持续了整整一夜, 谨慎万分清洗了整整三遍。然而二抗却未选准确妥当合适, 哎呀, 瞧瞧那整张膜宛如被泼洒了油漆一般模样, 背景亮度竟然比前景还要明亮许多。那般绝望无助的感受, 究竟谁能够真正明白知晓懂得。
咱们现在正在搜“二抗怎么选”, 咱们现在也正在搜“二抗浓度”, 咱们现在同样正在搜“二抗孵育时间”等词。我知道这些事。别着急, 今天咱们就把这些事儿掰扯得清清楚楚。
二抗到底是个啥？
说白了，二抗就是一抗的“小跟班”。
由有着专属使命的一抗去捕获目标蛋白, 肩负另一职责一为抓一抗的二抗登场。它自身携带着一种特殊标识物——此标识物要么是辣根过氧化物酶（HRP）, 要么是荧光染料。一抗发挥自身作用成功锁定位置, 二抗则承担起照亮那个已被锁定位置的任务。
你看到的条带，其实都是二抗的功劳。
没有二抗，你的一抗就是瞎子在黑夜里找人，谁也看不见谁。
选二抗最怕什么？
怕种属搞混。
将小鼠源的一抗, 你非要使用抗小鼠的二抗? 那行得通。然而要是免源的一抗, 二抗却用了抗小鼠的……那就如同派遣了一位不认识道路的快递员, 在整条大街上胡乱投递, 最终结果不言而喻。
还有一个坑：交叉反应。
存在一些二抗, 其表现得极为“博爱”, 不但会抓取你所需要的一抗, 而且还会抓取膜上附带的其他各类杂乱无章的东西。最终, 你跑出来的条带恰似地铁线路图那般, 呈现出密密麻麻的状态, 根本无法进行分辨查看。
故而呀，在购买二抗之前, 务必要仔细看清说明书之中的交叉反应测试数据。切不可贪图价格低廉。
二抗浓度到底怎么摸？
这一问题都被问腻乎了, 是1比5000 , 是1比10000 , 又或者是1比20000?
实话实说，没有标准答案。
针对不同品牌, 不同批次的二抗, 其活性并非相同。你依照师兄所给的配方去进行操作, 然而人家最终呈现出条带, 你却只得到空气。
我的笨办法：先做梯度实验。
那1:5000的做次尝试, 1:10000的也做次尝试, 1:20000的同样做次尝试, 1:40000的也都做次尝试。要是哪个背景呈现干净状态, 并且其信号表现为最强, 那就选择哪个。不要害怕会出现浪费情况, 因为这点所花费的时间是值得的。不然的话, 你之后要是回头再去重复进行实验, 所浪费掉的抗体以及时间会更多。
孵育时间耽误事吗？
很多人觉得二抗孵育无所谓，扔进去摇一摇就完事了。
大错特错。
孵育的时长若过于漫长, 那背景噪声便会将信号予以淹没。而要是孵育时间太过短暂, 信号又会软弱得如同蚊子发出的叫声一般。
室温下，45分钟到1小时，足够了。别超过2小时。
假设你一定要进行孵育过夜的操作, 那么要记住运用4度的条件。然而说实话, 这并没有必要。因为二抗并不像一抗那般“娇气”, 它的反应速度是非常之快的。
封闭液跟二抗有啥关系？
关系大了去了。
若你封闭工作没妥善完成, 二抗便会与膜上并非特异性的位点相结合, 随后就算你洗膜洗到双手因抽筋而无法正常活动停顿下来, 背景依旧令人感到无奈且效果乏善可陈。
最好封闭液与二抗属于同一种动物来源, 举例来说, 倘若你的二抗是山羊抗兔，那么最好封闭液采用正常山羊血清, 如此这般二抗便不会被封闭液“勾引”而离去。
可以使用脱脂奶粉, 它既便宜又好用。但是不要使用太长时间, 因为奶粉里面可能存在生物素, 而生物素会对某些检测系统造成干扰。
洗涤这一步别偷懒
我知道你们都想省时间。一次洗5分钟？两次就完事？
我告诉你，洗涤是决定成败的最后一道防线。
洗的时候使膜充分晃动, 要用TBST洗, 次数得至少三次, 每次时长是十分钟, 摇床转速可别弄太低。
若是你处于赶时间的状况, 那起码也得洗达到相应次数, 不然那些尚未结合的二抗还在膜上就不离开, 待你进行一曝光, 它们全部出来“跳舞”呢。
二抗保存有讲究吗？
有。
绝大部分二抗是添加了甘油的, 能够放置在零下二十度进行冷冻保存。然而, 切勿进行反复的冷冻与融化操作。需将其分装为小的管装形式, 每使用一管便更换新的。一旦从冷冻状态取出使用后, 就不要再放回原冷冻处了。
存有一些二抗呈液体状态, 于4度的环境下也能够放置一段时光。但说真的更为妥当的做法是去查看所述的说明书。那说明书仿若亲妈一般, 它表明怎样进行处理那就按照怎样去施行。
荧光二抗要特别注意
如果你的二抗是带荧光的，那就更得小心了。
在整个过程当中要避免光线直接照射, 在进行孵育操作期间拿锡纸将其包裹起来, 在清洗的时候也要尽量做到将灯关闭, 荧光染料一旦接触到光线就会产生类似“兴奋”的反应, 这种“兴奋”反应结束之后就会出现衰减的情况, 当你进行曝光操作的时候倘若发现信号变弱了，并非是蛋白没有成功转移过去, 而是光线使得染料如同被“吓”到一样消失了。
另外, 荧光二抗所采用的稀释比例通常而言是要比HRP要高一些的, 千万别依照HRP的经验去进行配制, 否则会出现过曝的情况。
最后说点实在的
二抗此物, 倘若选确切妥当了, 那你的实验就会事半又功倍, 要是选错了, 即便你那首抗堪称再好, 也全然是徒劳无功。
太多人被见, 一抗买最贵的那种, 二抗买最便宜的那种, 结果出来的数据没法看, 还得重做, 造成得不偿失的状况。
所谓二抗, 并非是处于次要地位的角色, 它乃是你所进行实验里的“翻译官”, 能够将你的蛋白信号转化为凭借肉眼就能够看见的条带, 而其翻译效果的优劣程度, 会对最终你文章的质量档次起到决定性作用。
多花点心思在上面，不亏。
接下来一次操作Western的时候, 在动手去做之前, 先停顿下来, 好好地思考一番: 我所选用的二抗, 真的是正确无误地选好了么。
