要讲真的话, 头一回碰到“酶标记抗体”这个东西之际, 我的整个人处于发懵的状态。
那种感觉晓得吧——试剂盒说明书反复琢磨瞧了三遍, 单个的字都认得, 可要连贯在一起瞧就是弄不明白它忙活的啥。更叫人抓狂的是, 旁侧的师兄师姐都手脚麻利地加样、孵育、显色, 仿若这是生来就有的本事。
后来我花了整整一个下午，盯着那管透明的液体发呆。
赋予抗体以酶标记这样一种形式, 确切来讲是给抗体装配了一个如同“信号放大器”般的存在。此抗体承担着精确寻觅目标蛋白的职责, 而酶则肩负着将肉眼无法察觉的信号转变为颜色改变或者发光现象的任务。事情便是这般简易。
但我当时就是绕不过这个弯。
为什么要给抗体装个“酶”？
直接检测抗体不行吗？行，但灵敏度太差了。
试着去想象一番, 你身处于一个完全漆黑的房间之内, 去寻觅一颗小小的米粒。直接这般去看的话, 基本上是没有什么胜算可能的。然而要是这颗米粒之上捆绑着一只会发出光亮的萤火虫呢? 哪怕其仅仅闪烁一下, 你也能够马上锁定它所在的位置。
酶就是那个萤火虫。
它能够将一个抗原抗体相结合的事件, 予以放大, 使之成为几百万个酶分子催化底物所产生的信号。这便是ELISA之所以能够检测出纳克甚至皮克级别的蛋白的原因。
酶标抗体怎么选？我踩过的坑
第一次买酶标抗体，我完全不知道要关注什么。
隨手挑了個價格最低廉的那般, 結果表明背景高得仿若塗了一層醬油似的。第二次吸取了先前乖覺的經驗, 選取了最昂貴的, 但因保存時候方法不恰當, 致使酶活性全然消失殆盡了。
后来我才摸出点门道：
辣根过氧化物酶, 也就是HRP, 是最为常用的, 具备价格便宜、活性高以及底物选择多这些特点。然而, 它对于叠氮钠是敏感的情形, 以至于在保存液当中不能够添加防腐剂。我当初恰恰就是在这上面栽了跟头。
碱性磷酸酶稳定性更佳, 背景较低, 然而其底物较为昂贵, 并且有些底物是具有致癌性的。在进行免疫组化操作时, 我偏好选用碱性磷酸酶, 因为其显色更为美观。
重点在于看你打算开展什么样的实验, 要是进行ELISA的话, HRP是足够的, 而要是开展组织切片染色, AP或许会更适宜。
别被说明书吓到——实际操作没那么玄乎
头一回搞 ELISA, 我依照说明书, 每一步骤都精准计时, 就连洗板都得掰着指头数秒。
结果呢？
背景高得离谱，标准曲线R²只有0.8。
后来老师跟我说：“你洗得太用力了，酶标抗体都被你冲跑了。”
我这才发觉, 酶标记抗体其本质为蛋白质, 它相当脆弱, 剧烈地进行吹打, 反复地予以冻融, 处于高温环境, 曝于强光之下, 均能够致使它失去活性, 故而在操作期间要温和, 仿若对待一个刚刚诞生的婴儿那般。
保存酶标抗体，记住一句话：分装、避光、别反复冻融
我曾目睹有人将一整管酶标抗体从冰箱之中取出, 加以使用一番后, 又放回到原处, 待到次日之时, 再次拿来使用。
两次之后，信号就只剩一半了。
准确的做法是: 收到试剂之后, 马上将其分装成为小份, 一次只使用一管。用不完的稀释液, 不要进行回收。HRP对光具有敏感性, 需要规避光线保存。
另外, 千万不要放置在零下二十摄氏度的环境！要是甘油的浓度不足的情形下就会出现结冰现象, 而冰晶会对抗体结构进行破坏。
为什么有时候酶标抗体检测结果不稳定？
这个问题困扰了我很久。
明明是同样的样本, 明明是同样的流程, 这次信号强到了爆炸的程度, 下次却又弱得好似根本没有显色一样。
后来发现，问题出在孵育时间上。
酶标记抗体跟靶标的结合是需要时间的, 然而时间要是太长的话, 就会使得非特异性结合有所增加, 通常是在37℃的环境下孵育1小时, 或者是在4℃的环境下过夜, 不过每个抗体都有着自身独特的情况, 最佳条件是需要自己去进行摸索的。
还有一种较为常见的缘由在于, 封闭的程度并不足够充分。存在于膜上的空白位点未能妥善封好, 如此一来，酶标抗体便会出现胡乱粘贴的情况, 进而导致背景变得脏污不堪！
你可能会遇到的最抓狂的问题——显色后没有信号
啊，这个我最有发言权。
那次, 我进行了ELISA操作, 做了数量为整整96个样本的检测, 在显色之后, 除了空白孔之外, 其余呈现的状态都是一片白色。
我当时想死的心都有了。
详细地排查了一番, 底物呈现出新鲜的状态, 孵育的温度处于正确的数值, 洗板的操作不存在任何问题。最终经过仔细查看, 才发觉竟然是自己忘记向其中添加酶标抗体了。
对，就是直接跳过了那一步。
于是乎当下我开展实验之时, 每一个步骤均于笔记本上将勾打上, 切莫过度信赖自身的记忆力, 特别是处于重复机械性的操作阶段之时。
再聊聊那些“玄学”但真实存在的细节
有人觉得酶标抗体实验看运气。
我不这么认为。
它具备着相当的灵敏, 然而它也是极为实在的。当你切实依照规范去进行操作之时, 它便会给予你相当让人满意的成果的；要是你行事随意马虎的话, 它进而就会给你呈现出杂乱无章的数据的。
比如进行洗板操作时, 好多人会产生这样的想法, 觉得多洗上几遍总归是不会出错的。然而要是洗的次数过多的话, 就有可能会把抗体从板子上面给冲下来。通常来讲, 洗5次便可达到要求, 每次浸泡的时长在30秒至1分钟之间。
又比如说加样, 绝对得防止出现气泡, 气泡会致使反应不均衡, 进而使得结果呈现出怪异的状态, 十分不协调呢。
其实酶标记抗体没你想的那么复杂
写这些不是要吓唬你。
恰恰相反，我想说：这些坑我都替你踩过了。
将酶标记在抗体上形成的酶标记抗体, 是一种工具, 当你理解了它的原理, 并且尊重它的特性时, 可以帮您拿到稳定的数据。
别怕遭遇失败, 每一个参与做实验的人, 都是从犹如一锅浆糊般的状态逐步走过来的, 我首次进行Western blot操作, 显影呈现出来的整张膜黑得仿若墨汁一样, 师兄瞅了一眼之后说道: “你这抗体浓度过高了。”。
稀释10倍，再试，就出漂亮条带了。
所以如果你现在正对着那管酶标抗体发愁——别着急，慢慢来。
它会给你答案的。
