回想起来怪难为情的, 才着手做流式的那个阶段, 我着实叫抗体给坑苦了。
彼时才刚进入实验室, 师兄递给我一管细胞, 言道“去染个CD4、CD8吧”, 我当时心里想着, 这能有多困难。而后跑去冰箱翻找抗体, 只要看到写有CD4以及CD8字样的管子便拿取, 添加完毕后拿去置于机器检测, 咦, 怎么全部都是呈现双阳性的呢 ,不合理。可是后来被狠狠责骂了一番之后才发觉 ,所拿取的竟然是处于同一荧光通道的两支抗体。
嘿, 你讲说冤不冤? 实际上, 压根儿就一点都不冤, 新手去踩坑, 十个里头有八个都是按照这个样子经历过来的。
流式抗体到底怎么选
选抗体这事，说简单也简单，说复杂……那真的是门玄学。
首先, 你必须要想明白, 你的细胞究竟是源于何种地方的。是人的, 还是小鼠的, 又或者是大鼠的, 亦或是猴子的? 不同物种所产生的抗体是无法通用的, 这一点大家通常都是清楚的, 然而很多人却会忽视掉一点, 那就是即使是同一种属之间, 不同的亚型、不同的品系, 其表达量也极有可能存在很大的差异。
比如说, C57BL/6小鼠以及BALB/c小鼠, 在表达水平上, 某些表面标记存在着差异变化状态。要是你直接套用其他人已经优化形成了的方案, 那么最终所呈现出来的结果有可能会处于尴尬不便的状况之中。
然后是荧光素的选择……哇，这个坑更多。
荧光素你真的了解吗
很多人觉得，反正都是染色的，哪个亮用哪个呗。大错特错。
我碰见一位同学, 购置了一粗大管子PE - Cy7的抗体用于细胞表面染色, 然而跑出的结果全是背景。这是为何呢? 原因在于, PE - Cy7对于固定剂格外敏感, 要是你运用含有甲醇的固定液, 那它的荧光会直接灭掉一半。
另外, FITC 的确价格较为低廉, 然而其光稳定性甚为糟糕, 倘若你在将其上机之前, 未曾进行避光保存操作, 那么信号衰减的程度就如同手机电量一般。
你实际上所要思索的是, 你的机器配置能不能支持这个通道, 你的实验有没有做多色的必要, 要是做多色的话, 不同荧光素的溢出该如何去调控?
这些问题，比挑抗体本身复杂十倍。
买贵的就一定好吗
不一定。
曾经有一回, 我们实验室的经费处于充足状态, 咬着牙购买了数量众多的BD这个品牌的大牌抗体, 然而染出来的效果竟然比不上之前所使用的国产小品牌, 这是为什么呢? 原因在于那一批抗体的克隆号针对的就是细胞系, 并非原代细胞的表位, 交叉反应糟糕到了极点。
价格高昂的物品, 有时仅仅是在品牌所带来的额外价值以及销售渠道所产生的成本方面显得昂贵罢了, 并不一定就契合于你所开展的实验体系。
我在之后进行了一次经验的总结: 于购买抗体之前, 要先去查阅相关文献, 以查看其他人所使用的是何种克隆号。当克隆号正确无误时, 就算牌子并非十分突出明显, 最终的结果也不大可能差到哪里去。
抗体稀释比例怎么确定
好多人的习惯是——说明书写多少就加多少。
说真心话, 这可是最为愚笨的方法。说明书里所标记的比例乃是通用性的推荐状态, 然而你的细胞数量是不同的, 样本类型也有着差异, 染色条件同样不一样, 怎么会是完全一模一样的呢?
我通常会去做一回梯度稀释测试, 像是1:50的比例染一管, 1:100的比例染一管, 1:200的比例染一管, 1:400的该比数再染上一管, 在完成之后去查看哪一个比例呈现出来的分离度算作最好的, 哪一个比例所产生的背景是最低的。在许许多多通常的时刻你会发觉, 那说明书所推荐的比例为1:100, 可是切切实实操作时1:200这样的比例所产生的效果反倒更好一些, 并且还能够节省掉一半的金钱。
省下来的钱干点别的不好吗？
保存和使用有多重要
这个事我吃过亏。
有一回购买了一批抗体, 到货之时未曾留意去查看, 便当即将其直接放进了4度温控的冰箱之中。然而两周之后把它拿出来, 染色之后呈现出来的却全都只是背景。随后经过询问才得以知晓, 某些荧光素偶联的抗体可是不可以采用4度来作长期保存的, 需得进行分装后放置于 -20度并且要避开避光的环境。
另外, 抗体忌讳冻融, 一次冻融或许会致使10%至20%的活性丧失, 两次三次如此这般后, 基本上就毫无用处了。
所以当下我拿到抗体后首要之事便是分装, 以小管形式分装，只需够一次使用即可, 每取用一管便拿出一管, 剩余的切实规规矩矩冷冻起来。虽说如此做会略显麻烦, 然而相较于实验失败后重新开展实验, 这般还是较为划算的。
买之前先确认这几点
我现在买流式抗体的流程是这样的：
先前查看克隆号, 是否存在文献予以支持? 其他人所使用的是什么情况? 没有文献依据的便直接摒弃。
接着看荧光素, 我的机器存在这个通道吗, 在我打算做的条件之下这个荧光素稳定与否, 需不需要做胞内染色, 要是做胞内染色, 固定破膜剂会对它产生影响吗?
紧跟着查看品牌, 并非一定得追逐大牌, 然而得留意口碑, 询问周边同学, 或者前往论坛搜寻一下是否有人进行吐槽。
到最后再去看价格, 倒也不一定非要去买最为便宜的哟，不过性价比得能够说得过去。倘若预算是有限制的, 对于同克隆号的同类型产品而言, 国产那一类型的实际上是能够纳入考虑范围的。
最后说几句掏心窝的话
流式抗体这个东西，说到底就是个工具。
工具是否好用, 三分取决于质量, 七分在于用法, 你即便购置再好的抗体, 若操作不符合规范，保存存在不当之处, 并且方案设计不合理, 结果依旧糟糕。
与之相反, 你是否乐意投入一些心思, 进行学习, 开展测试, 加以优化, 即便使用普通品牌的抗体, 也能够得出出色的数据。
别老想着一步到位、一劳永逸。实验这东西，哪有那么简单？
慢慢来, 经历过的那些磕绊之处都会化作你的经验。等你往后带领师弟师妹之际, 也能够如同我这般絮絮叨叨讲述一大通——你猜猜他们会不会听呢?
大概率也不听。哈哈，这就是循环。
