说实在的, 进行实验操作的人最惧怕的是什么呢? 不是经历熬夜的情况, 不是出现加样直至手指感到抽筋的状况, 而是——历经三天不辞辛劳地进行操作后, 最终所得到的标准曲线如同心电图那般, 完全没有任何规律可循。
细胞因子 ELISA 试剂盒, 这些好似外貌相近且包装盒色彩斑斓、说明书页数繁多之物, 然而当你实际动手操弄时, 便会晓知其差异极大。
什么才算“好用”的试剂盒？
实验室里经验丰富的老手都明白, 对于一个称得上靠谱的试剂盒而言, 首先需要去查看考量的便是灵敏度。
有些盒子之上标记着“pg级检测”字样, 然而你的样品当中细胞因子的浓度起初便是低的, 经过稀释之后直接降至检测下限以下, 如此便等同于白做了。我曾见到有人购置了某个大牌的IL - 6试剂盒, 其标称灵敏度为0.5 pg/mL, 但测出来的结果全都是负值——随后更换了一个牌子, 针对同样的样本进行检测, 数据最终才显得正常了。
并非讲大牌就必然好, 而是要看其针对的是何种样本, 血清, 血浆, 细胞上清, 这三样物件的基质差别极大, 有些试剂盒在缓冲液里运行极快, 一旦遇上血清样本即刻出问题。
为什么重复性总是不稳定？
这个问题，问十个人，九个人遇到过。
有时候, 针对同一块板子而言, 其左边那一排的OD值, 跟右边那一排的OD值相比, 能够相差出百分之二十。你会认为, 情况是自己在加样的时候手抖了吗? 实际上, 很有可能是因为包被抗体分布得不均衡才导致的。对于质量优良的试剂盒来说, 生产厂家会在包被工艺方面投入精力 , 举个例子, 采用定向固定技术, 使得抗体的Fc 段全部朝着同一个方向, 如此一来, 结合效率就会很高, 变异系数自然而然也就低了。
可是, 在市面上存在的那些价格较为低廉的试剂盒呢, 常常情况下仅仅是把抗体随意地朝着板子吸附过去, 其方式就如同刷墙一般, 刷完之后就将其看作是已经完成了整个流程。倘若你购买到了这样的试剂盒, 就只能寄希望于自身能够有好运了。
另外还有那个终止液, 可别小瞧它。在一些试剂盒里, 加入该终止液后, 颜色变化极为剧烈, 读数窗口仅有三五分钟时间, 稍微慢上一点, 数据就会漂移不稳定。而质量可靠、性能稳靠的盒子, 颜色稳定起码能够支撑20分钟, 即便你慢悠悠地读取数据也不会有问题。
标准曲线到底该怎么看？
好多人拿到试剂盒之后, 首要之事便是依照说明书来做标准曲线, 倘若做出来的结果中R²达不到0.99, 便会开始陷入怀疑自己人生的状态。
实际上, 标准曲线并非仅仅只看R², 还得瞧曲线形态。优质的标准曲线, 呈现为S型, 其上下平台显著明晰, 中间段落线性状况良好。要是曲线自始至终都是平的, 或者斜率极为微小, 那就表明抗体亲和力欠佳, 检测范围狭窄。
另外, 标准品的复溶同样是个麻烦事儿。干粉状的标准品, 你仅仅用PBS冲洗一下, 再简单涡旋几下便觉得大功告成了吗? 这可不行。必须静置15分钟, 使得蛋白能够充分溶解掉, 而后再进行轻柔地混匀——千万不要用力猛甩, 一旦蛋白发生变性, 那么曲线就会直接宣告报废了。
给我留下尤为深刻印象的一回, 有一人竟然把标准品错当成了洗涤液, 还直接就往洗板机里面倒了进去……那天所进行的实验, 大体上基本上能够算得上是“为科学奉献自身”了。
交叉反应是个隐形杀手
你所进行检测的对象是IL - 1β , 然而当IL - 1α、IL - 18等这些同属于一个家族的因子数量增多的时候, 进而给你引发了一种交叉反应的情况, 最终使得数据直接呈现出虚高的状态。
会在说明书里列出交叉反应率的试剂盒才是比较好的, 一般情况下对其要求是低于1%。然而, 存在一些厂家根本就不进行测量, 或者即便测量了也不予以写明。在准备购买之前, 最好前往官网去查询一下是否具备详细的交叉反应验证数据。
尤其是在进行多因子联合检测之际, 此坑极易踏入, 你费尽心思检测得出IL - 6以及TNF - α皆处于高位, 然而实际上却是因交叉反应所导致的假阳性结果, 白白耗费感情。
保存和运输，比你想象的重要
酶联免疫吸附测定试剂盒大多需在二至八度的环境下进行保存, 然而存在一些抗体对于反复冻融极具敏感性。你将其购置回来后放置于冰箱之中, 每次在使用之前把它取出放置在室温环境长达半小时, 之后再放置回去, 像这样反复数次, 抗体的活性便会下降得几乎所剩无几了。
有的厂家会增加保护剂, 像是甘油或者蔗糖, 以使得抗体更具备承受更多折腾的能力。然而, 还有的厂家是什么都不添加的, 完全要依靠你极其精心地服侍照料。
问题存在于运输这一方面。当处于夏天之际, 快递车厢之内的温度能够达到50°C, 设若你所收到的试剂盒未曾放置冰袋, 又或者冰袋已然融化, 那么基本上是能够进行退货操作的。切莫对那少许的运费予以心疼, 毕竟一旦数据出现损坏, 所要付出的代价会更为高昂。
写在最后
的确说实话, 就做细胞因子ELISA此项事情而言, 不存在捷径可走。试剂盒若选对了, 便意味成功达到了一半；加样、接着洗涤、随后孵育这些细节倘若做好了, 另一半也就稳当了。
但说到底, 千万别去买太过便宜的。便宜自有其便宜的缘由，贵同样有贵的道理所在。你并非仅仅是在买一个盒子, 而是在购买一批关乎数据的可靠性相关物。
不要等到, 论文被审稿人, 质疑数据重复性那时候, 才懊悔当初, 没多花费那几百块钱。
