ATP含量试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是生物能量通货,能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。
测定原理:
肌酸激酶催化肌酸和ATP反应生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸含量,以此反应ATP含量。
自备实验用品及仪器:
分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。
试剂组成和配制:
酸性提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1支,4℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂二:液体1.5mL×1支,4℃保存;
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入500μL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体5mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:液体25mL×1瓶,4℃保存;
标准液:液体10mL×1瓶,2μmol/mLATP标准液,4℃保存;
ATP提取:
1、血清(浆)中ATP的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),进行冰浴匀浆,8000g 4 ℃离心10min;取上清液至另一EP管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
2、组织中ATP的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min,取上清至另一EP管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
3、细胞或细菌中ATP的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎1min(冰浴,强度20%或200W,超声2s,停1s),8000g 4 ℃离心10min;取上清液至另一EP管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30 min以上,调节波长到700nm,蒸馏水调零。
2、显色剂的配制:临用前请根据拟用显色剂体积(样本数×0.2 m L),按试剂四(mL):试剂五(mL)=1:5的比例配制。用多少配多少。
3、样本测定:
试剂名称(μL)
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测定管
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对照管
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标准管
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空白管
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样本
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10
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10
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标准液
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10
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10
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试剂一
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20
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20
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试剂二
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10
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10
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10
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10
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试剂三
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10
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10
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蒸馏水
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30
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30
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充分混匀,37℃准确水浴30min
37℃水浴20min后,700nm下测定各管吸光值
ATP含量试剂盒说明书注意:空白管和标准管通常只需要各做一个。每个测定管设一个对照管。
ATP含量计算:
1、血清(浆)中ATP含量计算
ATP含量(μmol/mL)=[C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ×V1]÷(V3×V1÷V2)=40×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
2、组织、细菌或细胞中ATP含量计算
(1)按蛋白浓度计算
ATP含量(μmol/mg prot)=[C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ×V1]÷(V1÷Cpr)=2×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
蛋白质含量需要另外测定。
(2)按样本鲜重计算
ATP含量(μmol/g鲜重)=[C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)=4×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
ATP含量(μmol/104 cell)=[C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)=0.008×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
C标准管:标准液浓度,2μmol/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
注意:最低检测限为10nmol/mL或10nmol/g鲜重或0.1nmol/mg prot