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ATP含量检测试剂盒

BH-9611126
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ATP含量试剂盒说明书

微量法 100/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,生物能量通货能荷是描述细胞能量代谢状态主要参数测定ATP含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态

测定原理:

肌酸激酶催化肌酸和ATP反应生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸含量,以此反应ATP含量

自备实验用品及仪器:

分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。

试剂组成和配制:

酸性提取液:液体60mL×1瓶,4保存

碱性提取液:液体60mL×1瓶,4保存

试剂一粉剂×1支4℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂:液体1.5mL×1支4℃保存

试剂三:粉剂×1瓶4℃保存;临用前加入500μL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂液体5mL×1瓶4℃保存

试剂五:液体25mL×1瓶4℃保存

标准:液体10mL×1瓶2μmol/mLATP标准液,4℃保存

 ATP提取

1血清(浆)中ATP的提取按照血清(浆)体积(mL:酸性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液,进行冰浴匀浆,8000g 4 ℃离心10min;取上清液至另一EP中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)

2组织中ATP的提取按照组织质量(g:酸性提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心10min取上清至另一EP管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)

3细胞或细菌中ATP的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎1min冰浴,强度20200W,超声2s,停1s),8000g 4 ℃离心10min;取上清液至另一EP管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,8000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30 min以上,调节波长到700nm,蒸馏水调零

2、显色剂的配制:临用前请根据拟用显色剂体积(样本数×0.2 m L),按试剂四(mL):试剂五(mL=15的比例配制。用多少配多少。

 

3、样本测定:

试剂名称(μL)

测定管

对照管

标准

空白

样本

10

10

 

 

标准液

 

 

10

10

试剂一

20

 

20

 

试剂二

10

10

10

10

试剂三

10

 

10

 

蒸馏水

 

30

 

30

充分混匀37准确水浴30min

显色剂

200

200

200

200

37水浴20min后,700nm下测定各管吸光值

ATP含量试剂盒说明书注意:空白管和标准管通常只需要各做一个。每个测定管设一个对照管。

ATP含量计算:

1、血清(浆)中ATP含量计算

ATP含量(μmol/mL)=[C标准管×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管) ×V1(V3×V1÷V2)=40×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管)

2、组织、细菌或细胞ATP含量计算

1)按蛋白浓度计算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C标准管×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管) ×V1(V1÷Cpr=2×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

蛋白质含量需要另外测定。

2)按样本鲜重计算

ATP含量(μmol/g鲜重)=[C标准管×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管) ×V1(V1÷V2)=4×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管W

3按细菌或细胞密度计算

ATP含量(μmol/104 cell=[C标准管×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管) ×V1(500×V1÷V2)=0.008×(A测定管-A对照)÷(A标准管-A空白管)

C标准管:标准液浓度,2μmol/mLV1:加入反应体系中样本体积,0.01mLV2加入提取液体积,2mLV3:加入血清(浆)体积:0.1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

注意:最低检测限为10nmol/mL10nmol/g鲜重或0.1nmol/mg prot

 

 

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