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线粒体呼吸链复合体Ⅱ/琥珀酸辅酶Q还原酶检测试剂盒

BH-9611132
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线粒体复合体试剂盒说明书

                                          微量法 100/96

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。

测定原理:

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二液体20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三液体1.5mL×1支-20℃保存;

试剂四液体25mL×1瓶,4℃保存;

试剂五粉剂×1支,-20℃保存

试剂六:液体2.5mL×1瓶,4℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一10uL 试剂三冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆600g4℃离心5min

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做)

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二2uL 试剂三超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅱ酶活性测定

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

1)工作液的配制:临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解,置37℃(哺乳动物)25℃(其它物种)孵育5min用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液,立即混匀,记录605nm处初始吸光值A12min后的吸光值A2计算ΔA=A1-A2

线粒体复合体试剂盒说明书活力单位的计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=113×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T =0.226×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.35×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=1118×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(W ×V÷V样总) ÷T=226×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.452×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.35×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cmd96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

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