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Ca++Mg++ ——ATP酶检测试剂盒

BH-9611130
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Ca++ Mg++- ATP活性测定说明书

                                微量法 100/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

Ca++ Mg++-ATP广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理:

根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液液体100mL ×1 瓶,4保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4保存。

试剂:粉剂×1-20保存;临用前加入6mL蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂:液体 2mL×1 瓶,4保存。

试剂:粉剂×1瓶,4保存。用时加入3mL蒸馏水, 4保存。

试剂:粉剂×1, 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4保存一周。

试剂:粉剂×1, 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4保存一周。

试剂液体25mL×1 瓶,室温保存。

试剂10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:试剂八 20倍稀释,即取 0.1mL试剂八1.9mL蒸馏水充分混匀

定磷剂的配制:H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

Ca++ Mg++- ATP活性测定说明书操作步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)

 

对照管

测定管

试剂一μL

65

45

试剂二(μL

60

60

试剂μL

 

20

  μL

 

100

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min

试剂μL

25

25

  μL

100

 

混匀,8000g,25℃离心10min,取上清液

3定磷EP管或96孔板中加入下列试剂

 

空白管

标准管

对照

测定

0.5μmol/ml标准磷应用液(μL

 

20

 

 

上清液(μL

 

 

20

20

蒸馏水μL

20

 

 

 

定磷试剂(μL

200

200

200

200

混匀,室温放置30min,在 660nm处,记录各管吸光值。

注意事项:

1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒100只能测 48Ca++ Mg++-ATP酶。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。

3、空白管和标准管只要做一管。

Ca++ Mg++-  ATPase活力的计算

1、血清(浆)Ca++ Mg++-  ATPase活力的计算:

定义:每小时每毫升血清(浆)Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mL[C标准管×V]×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷V÷T=7.5×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)

2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++-  ATPase活力的计算:

1)按蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h / mg prot)= [C标准管×V]×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷V×Cpr÷T =7.5×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

定义:每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[C标准管×V]×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷(W× V÷V样总)÷T=7.5×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷W

3按细菌或细胞密度计算:

定义:每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104 cell)= [C标准管×V]×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)÷(500×V÷V样总)÷T=0.015×A测定管-A对照管)÷A标准管-A空白管)

C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mLV总:酶促反应总体积,0.25mLV样:加入样本体积,0.1mL V样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,1/6小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

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