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转氢酶2检测试剂盒

BH-9611137
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线粒体转氢酶-2TH-2试剂盒说明书

                                      微量法 100/96

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

TH位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化NADH+NADP+NAD++NADPH相互转化,调节线粒体NAD(H)NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPHNAD+生成NADP+NADH

测定原理:

NADHNADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+TH-2催化APAD+还原生成APADHAPADH375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,计算TH-2活性。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二液体50mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三液体18mL×1瓶,4℃保存;

试剂四粉剂×1-20℃保存;

试剂:粉剂×1-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g4℃离心5min

③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做)

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-2活性测定

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

1)工作液的配制:临用前试剂四、五转移到试剂三中混合溶解置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A110min后的吸光值A2计算ΔA=A2-A1

线粒体转氢酶-2TH-2试剂盒说明书活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

 TH-2活性nmol/min /mg prot=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性nmol/min /g 鲜重=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=74.5×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性nmol/min /104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.149×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 LεAPADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.02 mLV样总:加入提取液体积,0.5mLT:反应时间,10 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

b.96孔板测定的计算公式如下

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

 TH-2活性nmol/min/mg prot=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性nmol/min/g 鲜重=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=149×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性nmol/min/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.298×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 LεAPADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cmd96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.02 mLV样总:加入提取液体积,0.5mLT:反应时间,10 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

 

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