线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
测定原理:
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
自备实验用品及仪器:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:80mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:2 mL×1瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五:8mL×1瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入4mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
试剂七:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
试剂八:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;
试剂九:液体10mL×1 瓶,室温保存。
定磷试剂的配制:按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入800uL试剂二和8uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅴ酶活性测定。
线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书测定步骤:
1、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
试剂名称(μL)
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对照管
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测定管
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试剂四
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10
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10
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试剂五
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40
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40
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样本
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50
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混匀, 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确水浴30min
混匀,4000g,25℃离心10min,取上清液
2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)
混匀,室温静置10min后,在 660nm处读取A测定管和A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
复合体Ⅴ活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)
V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T
=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T
=101.5× (ΔA-0.004) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.203× (ΔA-0.004)
V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。